Daalụ maka ịga leta Nature.com. Ụdị ihe nchọgharị ị na-eji nwere nkwado dị nta maka CSS. Maka ahụmịhe kachasị mma, anyị na-akwado ka ị jiri ihe nchọgharị emelitere (ma ọ bụ gbanyụọ ọnọdụ ndakọrịta na Internet Explorer). Ka ọ dị ugbu a, iji hụ na nkwado na-aga n'ihu, anyị ga-egosi saịtị ahụ na-enweghị ụdị na JavaScript.
N'adịghị ka ụmụ anụmanụ ndị dị n'akpụkpọ ahụ, a na-eche na ụmụ ahụhụ enweghị homonụ steroid nke nwoke na-enwe mmasị na nwoke. Na Anopheles gambiae, o yiri ka ecdysone steroid 20-hydroxyecdysone (20E) agbanweela iji chịkwaa mmepe àkwá mgbe ụmụ nwanyị na-emepụta ya2 ma kpalite oge mmeghachi omume mgbe ụmụ nwoke na-ebufe mmekọahụ. Ebe ọ bụ na mmepe àkwá na mkpakọrịta nwoke na nwanyị bụ àgwà ọmụmụ dị mkpa, ịghọta otu anwụnta Anopheles nwanyị si ejikọta ihe mgbaàmà homonụ ndị a nwere ike ime ka nhazi nke mmemme njikwa ịba ọhụrụ dị mfe. N'ebe a, anyị na-ekpughe na ọrụ ọmụmụ ndị a na-achịkwa site na steroid mmekọahụ dị iche iche site na netwọk dị mgbagwoju anya nke enzymes ecdysteroid-activating/inactivating. Anyị chọpụtara ecdysone oxidized nke nwoke, 3-dehydro-20E (3D20E), nke na-echebe nne na nna site na imechi nnabata mmekọahụ nwanyị mgbe nnyefe mmekọahụ na mmalite site na dephosphorylation. N'ụzọ dị mkpa, mbufe 3D20E kpalitere ngosipụta nke mkpụrụ ndụ ihe nketa ọmụmụ nke na-eme ka àkwá na-etolite n'oge ọrịa Plasmodium, na-ahụ na ahụike nke ụmụ nwanyị butere ọrịa. 20E sitere na ụmụ nwanyị anaghị ebute mmekọahụ. mmeghachi omume, mana ọ na-enye ohere ka ndị mmadụ na-akpakọrịta nwee ike itinye àkwá mgbe egbochiri kinases 20E na-egbochi. Nchọpụta nke homonụ steroid ụmụ ahụhụ a nke nwoke na ọrụ ya n'ịchịkwa nnabata mmekọahụ ụmụ nwanyị, ọmụmụ nwa na mmekọrịta ya na Plasmodium na-egosi ike nwere ike ibelata ọganihu ọmụmụ nke anwụnta na-ebute ịba.
Ọrịa ịba na ọnwụ na-arị elu ọzọ n'ihi oke mgbochi ọgwụ ahụhụ na-efe efe na anwụnta Anopheles, bụ́ naanị ihe na-ebute nje ndị na-efe efe na ụmụ mmadụ. Usoro ọmụmụ nke anwụnta ndị a bụ ihe na-adọrọ mmasị karịsịa maka ọgwụgwọ ọhụrụ maka ọrịa ịba n'ihi na ụmụ nwanyị na-alụ naanị otu ugboro; ime ka ihe omume mkpakọrịta nwoke na nwanyị a ghara ịdị ndụ ga-enwe nnukwu ike ibelata ọnụọgụ anwụnta n'ọhịa.
Ụmụ nwanyị na-enwe nkwarụ mmekọahụ mgbe ha natara homonụ steroid dị elu site n'aka ụmụ nwoke. Nnyocha egosila na ihe na-akpata nsogbu n'ịkpakọ nwoke na nwanyị ọzọ bụ 20-hydroxyecdysone (20E), hormone steroid nke a maara nke ọma dị ka onye na-achịkwa usoro molting n'oge ọkwa larval. Ike nke ụmụ nwoke imepụta na ibufe 20E agbanweela kpọmkwem na ụdị Anopheles bụ akụkụ nke subgenus Cellia7, nke a na-ekesa na Africa ma gụnye ihe ndị kacha dị ize ndụ nke ịba, gụnyere Anopheles gambiae. Nke a dị mkpa karịsịa n'ihi na n'ime ụdị ndị a, ụmụ nwanyị na-emepụtakwa 20E mgbe nri ọbara ọ bụla gasịrị, 20E na-akwali usoro oogenesis (lee ntụaka 8). Agbanyeghị, a maghị ihe dị ukwuu gbasara ụzọ ụmụ nwanyị si ejikọta akara sitere na isi mmalite abụọ dị iche iche nke ecdysone (nnyefe nwoke na ntinye nri ọbara) na-emebighị ikike nke ha ịlụ. N'ezie, ọ bụrụ na 20E nke ụmụ nwanyị mepụtara na-akpalite enweghị ndidi mmekọahụ, nke a ga-eduga na enweghị ike ịmụ nwa na ndị na-enye nwa agbọghọ nri, omume a na-ahụkarị na anwụnta ndị a5.
Nkọwa nwere ike ịbụ na ụmụ nwoke A. gambiae na-ebufe ecdysone nke nwoke gbanwere agbanwe, nke na-eme ka usoro ọmụmụ nwanyị rụọ ọrụ, na-ebute enweghị ntụkwasị obi na njikọ nwoke na nwanyị. Agbanyeghị, ọ bụ ezie na ụmụ anụmanụ nwere ọtụtụ homonụ steroid, dị ka estrogen na androgen (enyochara na ntụaka 9), dịka anyị maara, achọpụtabeghị steroid ndị na-emegide androgenic n'ime ụmụ ahụhụ.
Anyị kpebiri ịchọpụta nchịkọta nke homonụ steroid dị na gland ihe mgbakwunye nwoke (MAG) nke A. gambiae tozuru oke mmekọahụ iji chọọ steroid ndị nwere ike ịgbanwe agbanwe. Site na iji chromatography mmiri dị elu yana tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) kama usoro a na-ejighị nke ọma eme ihe na mbụ, anyị chọpụtara ecdysone (E) na 20E na anụ ahụ a, na-akwado nsonaazụ gara aga. Agbanyeghị, steroid phosphorylated oxidized jupụtara na ihe nlele ahụ, nke kwekọrọ na usoro 3-dehydro-20E-22-phosphate (3D20E22P)12 (Foto 1). Ụdị ndị ọzọ gụnyere 3-dehydro-20E (3D20E) na 20E-22-phosphate (20E22P). Ike mgbaàmà HPLC-MS/MS nke 3D20E22P bụ usoro nha abụọ dị elu karịa ụdị dephosphorylated ya, 3D20E, na usoro nha atọ dị elu karịa nke E na 20E (Foto 1). Ọ bụ ezie na n'akụkụ ndị ọzọ nke ahụ na akụkụ ọmụmụ ala (LRT; Data Mgbatị 1a). Anyị nyochakwara ecdysteroids n'ime ụmụ nwoke na ụmụ nwanyị mechiri emechi ọhụrụ (ihe na-erughị otu ụbọchị) ma chọpụta 3D20E na 3D20E22P naanị na MAG; E, 20E na 20E22P dị na nwoke na nwanyị abụọ ahụ (Data Mgbatị 1b). Data ndị a na-egosi na ụmụ nwoke toro eto A. gambiae na-emepụta oke nke homonụ na-agbanwe agbanwe na MAG ha nke ụmụ nwanyị na-emepụtaghị.
E wepụrụ MAG na LRT nwanyị (gụnyere atria, seminal vesicles, na parovarium) n'ahụ ụmụ nwoke dị ụbọchị anọ (ụbọchị anọ) na ụmụ nwanyị na-amaghị nwoke na ndị lụrụ di (0.5, 3, na 12 hpm). E jiri HPLC-MS/MS (nkezi ± sem; nyocha t-test na-ejikọghị ọnụ, nke nwere akụkụ abụọ, ọnụego nchọpụta ụgha (FDR) dozie ya; NS, ọ bụghị ihe dị mkpa; *P < 0.05, **P < 0.01 . 3D20E: awa 3 vs. awa 0.5, P = 0.035; awa 12 vs. awa 3, P = 0.0015; awa 12 vs. awa 0.5, P = 0.030. 3D20E22P: awa 3 vs. awa 0.5, P = 0.25; awa 12 vs. awa 3, P = 0.0032; awa 12 megide awa 0.5, P = 0.015). Data sitere na ihe atọ dị ndụ. A gbakọrọ ma mee ka mpaghara elu maka ecdysone ọ bụla dị mma site na ọnụọgụ anwụnta. A na-egosi Ecdysone site na agba dị ka ndị a: E, akwụkwọ ndụ akwụkwọ ndụ; 20E, oroma; 20E22P, odo odo; 3D20E, acha anụnụ anụnụ; 3D20E22P, pink. Ihe dị n'ime ya na-eme ka nha dị na y-axis gosipụta ọkwa ecdysone dị ala.
Iji chọpụta ma 3D20E22P na 3D20E na-ebufe n'oge mmekọ nwoke na nwanyị, anyị kewara LRT ndị inyom n'oge dị iche iche mgbe mkpakọrịta nwoke na nwanyị gasịrị. Ọ bụ ezie na ahụghị ecdysone n'ime ụmụ agbọghọ, anyị hụrụ nnukwu 3D20E22P na LRT ozugbo mkpakọrịta nwoke na nwanyị gasịrị (awa 0.5 mgbe mkpakọrịta nwoke na nwanyị gasịrị, hpm), na-ebelata ka oge na-aga, ebe ọkwa 3D20E mụbara nke ukwuu (Foto 1). Site na iji 3D20E emepụtara na kemịkalụ dị ka ọkọlọtọ, anyị kpebiri na ọkwa nke hormone steroid a na njikọta LRTs dịkarịa ala okpukpu 100 karịa 20E (Tebụl Data agbatịkwuru 1). Ya mere, 3D20E22P bụ isi ecdysone nwoke nke a na-ebufe na LRT nwanyị n'oge mkpakọrịta nwoke na nwanyị, ụdị dephosphorylated ya, 3D20E, na-abawanye nke ukwuu obere oge ka njikọta nwoke na nwanyị gasịrị. Nke a na-egosi ọrụ dị mkpa maka ecdysone nke ikpeazụ na bayoloji mgbe mkpakọrịta nwanyị gasịrị.
Mgbe anyị mepụtachara usoro RNA ọhụrụ (RNA-seq) dataset (Foto 2a), site na iji paịpụ bioinformatics nke e wuru n'ụzọ omenala, anyị chọrọ ecdysone kinase (EcK), ecdysone oxidase (EO), na ecdysone nke na-agbanwe 20E-modified phosphatase gene. EPP) na-apụta n'ime anụ ahụ ọmụmụ. Anyị chọpụtara otu mkpụrụ ndụ ihe nketa EPP na mkpụrụ ndụ ihe nketa ECK abụọ nwere ike (EcK1 na Eck2), mana anyị enweghị ike ịchọta ezigbo mkpụrụ ndụ ihe nketa EO. Nke pụtara ìhè bụ na e gosipụtara mkpụrụ ndụ ihe nketa EPP nke ọ bụla n'ọkwa dị elu (pasent 98.9) na MAG Gambian mana ọ bụghị na LRTs nwanyị (Foto 2b), nke megidere atụmanya anyị kemgbe dephosphorylation nke 3D20E22P mere na anụ ahụ nwanyị a. Ya mere, anyị kwenyere na enwere ike ibufe EPP nwoke n'oge mkpakọrịta nwoke na nwanyị. N'ezie, anyị jiri in vivo stabilized isotope labeling iji zoo protein nwanyị mgbe njikọta, enzyme nke MS chọpụtara na atrium nwanyị (Foto 2c na Tebụl Mgbakwunye 1). E gosikwara na EPP dị na MAG ma nwee njikọ (mana ọ bụghị nwoke na nwanyị) nwanyị LRT site na iji ọgwụ mgbochi ụfọdụ (Foto 2d).
a, Ọwa bioinformatics nke e wuru nke ọma iji chọọ anụ ahụ ọmụmụ nke nwoke ọ bụla maka mkpụrụ ndụ ihe nketa nke na-agbanwe EcKs, EOs, na EPPs. Ọnụọgụ ndị dị n'akụkụ akụ na-egosi ọnụọgụgụ ndị nwoke na nwanyị na-aga ime na nzọụkwụ ọ bụla. Nyocha a chọpụtara otu mkpụrụ ndụ ihe nketa EPP (EPP) na otu mkpụrụ ndụ ihe nketa Eck (EcK1) nke a na-egosipụta n'ime ụmụ nwoke, na otu mkpụrụ ndụ ihe nketa ECK (EcK2) nke a na-egosipụta n'ime nwoke na nwanyị mana ọ naghị enye mkpụrụ ndụ ihe nketa EO.b, Heatmap na-atụnyere ngosipụta mkpụrụ ndụ ihe nketa onye na-aga ime na nwa agbọghọ (V) na mating (M) Anopheles gambiae na Anopheles albicans anụ ahụ.Spca, njikọta; MAGs, glands ngwa na ụmụ nwoke; Akụkụ ahụ ndị ọzọ, gụnyere ara, nku, ụkwụ, ahụ abụba, na akụkụ ahụ dị n'ime nwoke na nwanyị, yana ovaries n'ime nwanyị. EcK2 na-egosipụta nke ọma na MAG na atria nke Gambia, ebe a na-ahụ EPP naanị na MAG.c, nyocha Proteomic nke mgbanwe otu ejaculate nwoke gaa na atria nwanyị na 3, 12 na 24 hpm, na-egosi protein 67 kachasị baa ụba. A zụlitere ụmụ nwanyị na nri nwere 15N iji kpọọ (ma zoo) protein niile. A na-ejikọ ụmụ nwoke na-enweghị akara na ụmụ nwanyị akara, a na-ekewakwa LRT nwanyị na 3, 12 na 24 hpm maka nyocha proteomic (lee Tebụl Mgbakwunye 1 maka ndepụta zuru oke nke protein ejaculatory). A chọpụtara inset, EPP, Eck1 na Eck2 na MAG nke ụmụ nwoke na-amaghị nwoke site na nyocha proteomic nke anụ ahụ ndị a.d, a chọpụtara EPP site na western blot na MAG na LRT nke ụmụ nwanyị lụrụ di, mana ọ bụghị na ụmụ nwanyị na-amaghị nwoke ma ọ bụ ụmụ nwoke ma ọ bụ ahụ nwanyị ndị ọzọ. A na-enyocha membranes n'otu oge nwere ọgwụ mgbochi-actin (njikwa ibu) na ọgwụ mgbochi-EPP. Ụmụ nwoke niile bụ ụmụ agbọghọ. Lee Foto Mgbakwunye nke 1 maka data isi mmalite gel. Emere Western blots ugboro abụọ yana nsonaazụ yiri nke ahụ.
E gosipụtara ọrụ ecdysteroid phosphophosphatase nke EPP mgbe HPLC-MS/MS tinyere 3D20E22P nke e kewapụrụ na MAG (Extended Data Fig. 2a). Ọzọkwa, mgbe anyị mechiri EPP site na nnyonye anya RNA (RNAi), anyị chọpụtara mbelata dị ukwuu na ọrụ phosphatase na anụ ahụ ọmụmụ nke ụmụ nwoke ndị a (Fig. 3a), ụmụ nwanyị ndị jikọtara na ụmụ nwoke EPP-selenced gosiri nnukwu A obere akụkụ nke dephosphorylated 3D20E (Fig. 3b) n'agbanyeghị mmechi mkpụrụ ndụ ihe nketa (Extended Data Fig. 2b,c). N'ụzọ dị iche, anyị achọpụtaghị mgbanwe dị ukwuu na oke 20E22P/20E na otu anwụnta ahụ, nke nwere ike igosi na enzyme ahụ bụ kpọmkwem maka 3D20E22P (Fig. 3b).
a, Mbelata ọrụ phosphatase na MAG nke sitere na mmechi EPP site na iji njikwa EPP RNA nke nwere eriri abụọ (dsEPP) ma ọ bụ njikwa GFP RNA (dsGFP) nke nwere eriri abụọ. Ejiri ọdọ mmiri MAG iri abụọ mee ihe na nke ọ bụla (P = 0.0046, ule t jikọtara ọnụ, akụkụ abụọ), nke ntụpọ dị iche na-anọchite anya ya.b, Ụmụ nwanyị ndị nwere ụmụ nwoke nwere EPP nwere oke dị ala nke dephosphorylated 3D20E na 3 hpm (P = 0.0043, ule t nke enweghị njikọ, akụkụ abụọ), ebe ọkwa 20E emetụtaghị (P = 0.063, enweghị njikọ). ule t, akụkụ abụọ). A na-egosi data dị ka nkezi ± sem site na ọdọ mmiri atọ nke nwanyị 13, 16 na 19 nke ọ bụla.c, Ụmụ nwanyị ndị lụrụ nwoke EPP nwere oke mmụba nke mkpakọrịta nwoke na nwanyị ọzọ (P = 0.0002, ule Fisher kpọmkwem, akụkụ abụọ). A manyere ụmụ nwanyị mbụ ịlụ iji hụ na ha nwere ọnọdụ mkpakọrịta nwoke na nwanyị; Mgbe ụbọchị abụọ gachara, e metụrụ ha aka na ụmụ nwoke ndị ọzọ bu mkpụrụ ndụ ihe nketa iji chọpụta ọnụego mmekọ ọzọ site na nchọpụta PCR nke transgene.d. Ụmụ nwanyị ndị a na-enye ọbara na ndị ikom EPP-delenced nwere mbelata nke ukwuu n'ọmụmụ (P < 0.0001; ule Mann-Whitney, akụkụ abụọ) na ọnụọgụ àkwá dị ntakịrị belatara (P = 0.088, ule Mann-Whitney, akụkụ abụọ), ebe ọnụego ịmụ nwa adịghị emetụta (P = 0.94, ule Fisher kpọmkwem, akụkụ abụọ). Na panel niile, n na-anọchite anya ọnụọgụ nke ihe nlele anwụnta na-adabereghị na ihe ndị dị ndụ.NS, ọ bụghị ihe dị mkpa.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001.
Na-esote, anyị tụlere ma ecdysone dephosphorylation dị mkpa maka ịkpalite iguzogide mmekọ nwoke na nwanyị. Ihe dị mkpa bụ na ụmụ nwanyị ndị nwoke na-enwe mmekọahụ na EPP na-akpakọrịta ọzọ ugboro ugboro dị elu (44.9%) karịa ụmụ nwanyị na-achịkwa (10.4%) mgbe ekpughere ha nye ụmụ nwoke ndị ọzọ (transgenic) (Foto 3c). Anyị hụkwara mbelata dị ukwuu na ọmụmụ nwa (Foto 3d, aka ekpe) na obere mbelata na ọnụọgụ àkwá nke ụmụ nwanyị ndị a na-etinye (Foto 3d, etiti), ebe pasent nke àkwá nke ụmụ nwanyị na-etinye (mmeghachi omume ọzọ nke na-akpalite na ụmụ nwanyị site na mkpakọrịta nwoke na nwanyị)) emetụtaghị (Foto 3d, aka nri). N'iburu nkọwapụta nke EPP maka 3D20E22P, nsonaazụ ndị a na-egosi na mkpali nke 3D20E site na EPP ebufere n'oge mkpakọrịta nwoke na nwanyị nwere ike inwe ọrụ dị mkpa n'ịgbanyụ nnabata ụmụ nwanyị maka mkpakọrịta nwoke na nwanyị ọzọ, omume nke ekwuru na mbufe mmekọahụ nke 20E. Ya mere, homonụ nwoke a na-emetụtakwa ọmụmụ ụmụ nwanyị nke ukwuu.
Na-esote, anyị tụnyere ọrụ nke 20E na 3D20E na nnwale ọgwụ n'ime ụmụ agbọghọ tozuru okè n'ihe gbasara mmekọahụ site na iji 3D20E emepụtara na kemịkalụ (Foto 4a–c) na nke dị na ahịa 20E. Anyị hụrụ na 3D20E dị irè karịa 20E n'imechi mmetụta ụmụ nwanyị na njikọ na njupụta abụọ ahụ (Foto 4d). Nke pụtara na ọkara ọkwa physiological nke 3D20E na LRT (1,066 pg mgbe ịgba ọgwụ vs. 2,022 pg mgbe ịgba ọgwụ) kpaliri oke nke ụmụ nwanyị na-anaghị emegharị ahụ nke dị okpukpu 20 karịa ọkwa physiological nke 20E (361 pg mgbe ịgba ọgwụ) awa 24 mgbe ịgba ọgwụ n'ime njupụta kachasị elu 18 pg mgbe ịgba ọgwụ n'ime; Tebụl Data Gbasara 1). Nsonaazụ a kwekọrọ n'echiche na nnyefe mmekọahụ nke 20E anaghị akpata oge ndị na-anaghị emegharị ahụ, ma na-egosikwa na 3D20E dị ka ihe dị mkpa n'ịhụ na mmekọrịta nne na nna na nwa. 3D20E na-arụkwa ọrụ karịa 20E na nyocha nke itinye àkwá n'ime ụmụ nwanyị na-amaghị nwoke (Foto 4e), na-egosi na ọnụego itinye àkwá nkịtị anyị hụrụ mgbe emechara mmechi EPP nke ụfọdụ bụ n'ihi ọnụnọ nke ọrụ 3D20E fọdụrụnụ nke ihe ndị inyom na-akpata Mating na-emepụta.
(a,b) 3D20E ejiri kemịkalụ mepụta site na 20E (a) yana nnukwu mgbanwe/arụmọrụ (data egosiri dị ka nkezi ± sem sitere na mmeghachi omume njikọta onwe atọ) (b).c, Oke spectrum (ọkara ala) dakọtara kpọmkwem na ecdysone achọtara na LRT nwanyị ejikọtara ọnụ (ọkara elu).d, Ma e jiri ya tụnyere 20E (0.63 µg, P = 0.02; 0.21 µg, P < 0.0001; Nnwale kpọmkwem Fisher, akụkụ abụọ) na 10% ethanol (0.63 µg, P < 0.0001; 0.21 µg, P < 0.0001; Nnwale kpọmkwem Fisher, akụkụ abụọ), ebe 20E dị elu karịa njikwa naanị na oke doses (0.63 µg, P = 0.0002; 0.21 µg, P = 0.54; Nnwale kpọmkwem Fisher ule, akụkụ abụọ).e, ọgwụ 3D20E butere ọnụego ịmụ nwa dị elu karịa nke ụmụ nwanyị na-amaghị nwoke karịa njikwa ethanol 10% (0.21 µg, P < 0.0001; 0.13 µg, P = 0.0003; ule Fisher kpọmkwem, akụkụ abụọ), ebe 20E ma e jiri ya tụnyere njikwa Naanị na doses dị elu (0.21 µg, P = 0.022; 0.13 µg, P = 0.0823; ule Fisher kpọmkwem, akụkụ abụọ). 3D20E butere ọnụego ịmụ nwa dị elu karịa 20E na doses dị elu (0.21 µg, P = 0.0019; 0.13 µg, P = 0.075; ule Fisher kpọmkwem, akụkụ abụọ). Na panel niile, n na-anọchite anya ọnụọgụ nke ihe nlele anwụnta na-adabereghị na bayoloji.NS, ọ bụghị ihe dị mkpa.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001. Data sitere na ihe atọ e ji mee ihe.
N'ọmụmụ ihe ndị gara aga, anyị chọpụtara na mbufe homonụ steroid na-akpali ngosipụta nke MISO (Mkpalite Mmekọahụ nke Oogenesis 11), mkpụrụ ndụ ihe nketa ọmụmụ nke nwanyị nke na-echebe ụmụ nwanyị A. gambiae site na ọrịa P. falciparum Ọnụ ego ahụike nke 13 kpatara, nje ịba kacha egbu mmadụ. N'iburu mkpa MISO dị na ahụike ọmụmụ nke Anopheles na mpaghara ịba jupụtara na ya, anyị kpebiri ikpebi homonụ 3D20E ma ọ bụ 20E na-akpali ngosipụta nke mkpụrụ ndụ ihe nketa a. Anyị chọpụtara na ọ bụ ezie na ntụtụ 20E kpọmkwem ma ọ bụ karịa na-akpali ụfọdụ ndị na-anabata homonụ nuklia (HR), dị ka HR3 na HR4, na ebumnuche steroid nkịtị, dị ka mkpụrụ ndụ ihe nketa yolkogenic Vg14, 15, 16, MISO ka 3D20E kpaliri nke ukwuu (Foto data agbatịkwuru 3). Ya mere, mbufe mmekọahụ nke hormone steroid androgenic a yiri ka ọ na-akpali usoro ndị na-echebe ụmụ nwanyị site na ọnụ ahịa nke ọrịa parasitic kpatara. Ọzọkwa, 3D20E na-emetụta ụdị abụọ nke EcR receptor, na-akpali EcR-A ma na-egbochi EcR-B, ma na-akpali mkpụrụ ndụ ihe nketa ndị ọzọ na-akpali mmekọ nwoke na nwanyị, gụnyere HPX15, nke na-emetụta ọmụmụ ụmụ nwanyị. Nke a nwere ike ịkọwa nnukwu enweghị ike ịmụ nwa a na-ahụ na ụmụ nwanyị ndị nwere ụmụ nwoke EPP-delenced (Foto data agbatịkwuru 3). Data ndị a na-egosi na enwere ụzọ ndị dị n'okpuru ala nke homonụ ecdysone abụọ na-arụ ọrụ nke nwere ike ịbụ ọrụ kpọmkwem maka mmekọahụ.
Na-esote, anyị nwalere ọrụ nke mkpụrụ ndụ ihe nketa Eck abụọ a chọpụtara na ọkpọkọ bioinformatics anyị. Ịgbachi nkịtị EcK1 ma ọ bụ EcK2 butere ọnwụ dị ukwuu n'ime ụmụ nwoke (Foto 4a nke Data Gbasara), na-egosi na ecdysone phosphorylation, ya mere enweghị ike ịrụ ọrụ, dị mkpa maka ndụ. N'ihi na e gosipụtara EcK2 n'ọkwa dị elu karịa EcK1 ma achọpụta ya na MAGs site na proteomics (Fig. 2b,c na Tebụl Mgbakwunye 2), anyị kwadoro ọrụ ecdysteroid kinase ya site na itinye ya na 20E, nke butere phosphorylation 20E22P (Foto 2b nke Data Gbasara).4b). Mgbe anyị na-eji 3D20E dị ka ihe ndabere, anyị enweghị ike ịchọpụta ngwaahịa phosphorylated 3D20E22P (Foto 4c nke Data Gbasara), na-atụ aro na 20E kama 3D20E nwere ike ịbụ ihe mgbaru ọsọ kachasị mma nke Eck2.
Dịka nyocha RNA-seq anyị si kwuo, EcK2 gosipụtara nke ọma na LRT nke ụmụ nwanyị na-amaghị nwoke, ebe a gbanyụrụ ya mgbe ha nwesịrị mmekọahụ (Foto 2b). Anyị kwadoro data ndị a ma chọpụta na nri ọbara anaghị emetụta ngosipụta EcK2 (Foto 5a) nke data gbasaara. Mgbe anyị gbatịchara nnwale MS mbụ anyị, anyị kpebiri na oke 20E22P nwere njikọ chiri anya na oke 20E (awa 22-26 mgbe ha risịrị nri ọbara; Foto 5b). Ịgbachi nkịtị nke Eck2 n'ime ụmụ nwanyị na-amaghị nwoke mere ka mmụba okpukpu atọ na oke 20E ruo 20E22P na awa 26 mgbe ha risịrị nri ọbara (Foto 2c na 5c), na-akwado na EcK2 na-emekwa ka 20E na-enweta phosphorylates n'ime ụmụ nwanyị. Nke a pụtara ìhè bụ na ụmụ agbọghọ na-enweghị EcK2 nọgidere na-anabata mmekọahụ zuru oke (Foto 5d,e), na-atụkwa aro na mmepụta ụmụ nwanyị nke 20E anaghị ebute oge ndị na-anaghị ekwenye na ha. Agbanyeghị, ndị a Ụmụ nwanyị enweela mmụba dị ukwuu n'ọkwa ịmụ nwa ma e jiri ya tụnyere ndị na-achịkwa ya, ihe karịrị 30% nke ụmụ agbọghọ na-amụ nwa (Foto 5f). Ọ bụrụ na e tinyere ọgwụ Eck2 RNA (dsEcK2) ugboro abụọ mgbe e nyechara ọbara, ịmụ nwa emeghị, ebe nke 20E kachasị elu n'ihi ịṅụ ọbara ebelatala. N'ozuzu, nsonaazụ ndị a na-akwado ụdị nke 20E mepụtara mgbe a mịrị ọbara nwere ike ibute ịmụ nwa, mana naanị mgbe agbanyụrụ ihe mgbochi ịmụ nwa (EcK2 na ikekwe ihe ndị ọzọ) site na mkpakọrịta nwoke na nwanyị. Ọ dịghị ọgwụ 20E ma ọ bụ 3D20E gbochiri ngosipụta Eck2 na ụmụ agbọghọ (Foto 5g nke Data Gbasara), na-egosi na ihe ndị ọzọ na-akwalite mgbochi nke kinase a. Agbanyeghị, ọkwa 20E mgbe a mịrị ọbara ezughị iji kpalite ahụ erughị ala nke mkpakọrịta nwoke na nwanyị, mana ọ bụ nke a kpaliri site na oke nke 3D20E ebufere mmekọahụ.
Nsonaazụ anyị na-enye nghọta dị mkpa n'ime usoro ndị na-achịkwa ọganihu ọmụmụ nke A. gambiae. Ụdị apụtala ebe ụmụ nwoke etolitela imepụta oke 3D20E, ecdysone agbanwere kpọmkwem nke nwoke nke na-eme ka nne na nna ha dị mma site n'ime ka ụmụ nwanyị ghara inwe mmetụta maka mkpakọrịta nwoke na nwanyị. N'otu oge ahụ, ihe ndị na-akpata ịba a emepụtakwala usoro dị irè iji mee ka 3D20E rụọ ọrụ n'ime ụmụ nwanyị dịka nzaghachi nye nnyefe mmekọahụ nke EPP kpọmkwem nke nwoke. Dịka anyị maara, nke a bụ ihe atụ mbụ nke usoro homonụ steroid nke nwoke na nwanyị na-achịkwa na-arụ ọrụ pụrụ iche na dị oke mkpa na ụmụ ahụhụ. A na-atụ aro ọrụ ecdysone kpọmkwem nke nwoke mana egosipụtaghị nke ọma. Dịka ọmụmaatụ, echiche 18 nke a na-anaghị ekwenye ekwenye bụ na 20E precursor E1 nwere ike ịrụ ọrụ ndị a. A maara nke ọma na na Drosophila, monandry na-akpali site na nnyefe mmekọahụ nke obere peptides mmekọahụ19,20 nke na-akpakọrịta na neurons na-abanye na usoro ọmụmụ nwanyị site na ndị nnata peptide mmekọahụ kpọmkwem21,22. A chọrọ ọrụ ọzọ iji chọpụta akara ala cascades nke 3D20E na-achịkwa n'ime ụmụ nwanyị A. gambiae na iji chọpụta ma enwere ike ịchekwa cascades ndị a n'etiti anwụnta na Drosophila.
N'iburu ọrụ dị mkpa nke 3D20E na ọmụmụ ụmụ nwanyị na omume achọpụtara n'ọmụmụ ihe anyị, ụzọ ndị na-eduga na mmepụta na mkpali 3D20E na-enye ohere ọhụrụ maka atụmatụ njikwa anwụnta n'ọdịnihu, dị ka mmepụta nke ụmụ nwoke na-asọmpi na atụmatụ teknụzụ ụmụ ahụhụ na-adịghị ọcha Jiri maka ntọhapụ ọhịa ma ọ bụ iṅomi 3D20E na egwuregwu nwa agbọghọ. Ọrụ nke nwoke nke 3D20E nwere ike ịmalite mgbe A. gambiae na ụdị Cellia ndị ọzọ nwetara ikike ijikọ mkpụrụ ha ka ọ bụrụ ihe mkpuchi njikọta, ebe nke a na-enye ohere maka mbufe dị irè nke ọtụtụ homonụ na enzymes na-eme ka hormone rụọ ọrụ. N'aka nke ya, mmejuputa evolushọn 3D20E na-enye usoro maka ụmụ nwanyị (site na ngosipụta dị elu nke MISO) iji kwado ahụike ọmụmụ ha na mpaghara ebe ịba dị elu, nke na-enye aka na mbufe Plasmodium. Ebe ọ bụ na egosiri na nwanyị 20E nwere mmetụta dị ukwuu na ndụ na uto nke P. falciparum na anwụnta Anopheles nwanyị, 24 ma ụzọ hormone steroid nwoke na nwanyị bụzi akụkụ dị mkpa nke mmekọrịta anwụnta na nje.
A. A zụlitere ụdị nje gambiae G3 n'okpuru ọnọdụ ụmụ ahụhụ nkịtị (26-28 °C, iru mmiri dị 65-80%, oge ìhè/ọchịchịrị nke awa 12:12). E nyere ụmụ ahụhụ ntụ ntụ nri azụ (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets na Tetra Pond Sticks n'ogo nke 7:7:2). E nyere anwụnta ndị toro eto nri ad libitum 10% dextrose solution na ọbara mmadụ kwa izu (nyocha ihe mejupụtara ọbara). E nwetara anwụnta virgin site na ikewapụ ụmụ nwoke na ọkwa ụmụ nwanyị mgbe ha lere anya na njedebe site na microscopy. A kọwapụtala na mbụ banyere ụmụ nwoke bu transgene DsRed.
E mere nnwale mmanye maka mkpakọrịta nwoke na nwanyị dịka usoro akọwara na mbụ si dị. Maka mkpakọrịta nwoke na nwanyị ebumpụta ụwa, a na-edebe ụmụ nwanyị dị ụbọchị anọ na-amaghị nwoke n'ime oke 1:3 na ụmụ nwoke tozuru etozu maka abalị abụọ. Maka nnwale ebe a gbara ụmụ nwoke ọgwụ dsEPP, njikọta mkpuchi ahụ dabara na ụbọchị 3-4 mgbe a gbasịrị ya ọgwụ, mgbe emechiri ọrụ phosphatase nke ọma (Foto 2b).
A gbawara anụ ahụ anwụnta, ozu ndị fọdụrụ (ahụ fọdụrụ), ma ọ bụ ahụ dum n'ime 100% methanol ma jiri beader mee ka ọ dị ka otu. Ọnụọgụ anụ ahụ na olu methanol dị ka ndị a: akụkụ ahụ fọdụrụ, 50 na 1,000 µl; MAG, 50–100 80 µl; nwanyị LRT, 25–50 80 µl. A na-ewepụ methanol nke abụọ na otu olu methanol. A na-ewepụ ihe mkpofu sel site na centrifugation. A na-ejikọta methanol sitere na mwepụ abụọ ahụ ma kpọọ nkụ n'okpuru mmiri nitrogen, wee kpọghachi ya na mpịakọta ndị a nke 80% methanol n'ime mmiri: akụkụ ahụ fọdụrụ, 50 µl; MAGs na nwanyị LRT, 30 µl.
A tụlere ihe nlele ndị a na igwe spectrometer (ID-X, Thermo Fisher) ejikọtara na ngwa LC (Vanquish, Thermo Fisher). A gbanyere µl nke ihe nlele ahụ na kọlụm 3 µm, 100 × 4.6 mm (Inspire C8, Dikma) nke edobere na 25 °C. Usoro mkpanaka maka LC bụ A (mmiri, 0.1% formic acid) na B (acetonitrile, 0.1% formic acid). Ndabara LC dị ka ndị a: 5% B maka nkeji 1, wee mụbaa ruo 100% B n'ime nkeji 11. Mgbe nkeji 8 gasịrị na 100%, gbanwee kọlụm ahụ na 5% B maka nkeji 4. Ọkwa mmiri ahụ bụ 0.3 ml nkeji-1. A na-eme ionization na isi iyi MS site na ionization electrospray ọkụ na ụdị dị mma na nke na-adịghị mma.
Igwe nlele oke ahụ na-atụ data dị na m/z site na 350 ruo 680 na mkpebi 60,000 na ọnọdụ MS zuru oke. E nwetara data MS/MS na [M + H]+ (ihe mgbaru ọsọ niile), [M - H2O + H]+ (ihe mgbaru ọsọ niile), na [M - H]- (ihe mgbaru ọsọ phosphorylated). E jiri data MS/MS kwado njirimara ecdysone nke ihe mgbaru ọsọ nke enweghị ọkọlọtọ maka ya. Iji chọpụta ecdysteroids na-abụghị nke ezubere iche, a nyochachara data MS/MS maka oke HPLC niile nwere oke nha nhata >15%. Jiri usoro ọkọlọtọ e kere site na ọkọlọtọ dị ọcha (20E, 3D20E) gbakọọ ọnụọgụ zuru oke ma ọ bụ dilutions nke otu ihe nlele kpọmkwem (ihe mgbaru ọsọ ndị ọzọ niile) iji gbakọọ nha nhata ha na ọnụọgụ ndị a hụrụ na otu nwoke. Maka 3D20E, emere nhazi site na iji ngụkọta nke mgbakwunye ndị a: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. E wepụtara ma tụọ data site na iji Tracefinder (ụdị 4.1). E jiri Xcalibur (ụdị 4.4) nyochaa data MS/MS. E jiri ọkọlọtọ ndị dị na ya tụnyere spectra MS nke E, 20E na 3D20E. E jiri 3D20E22P nyochaa ya site na iji reagent Girard. E jiri m/z tụnyere 20E22P.
E jiri MAG sachaa 3D20E22P. E jiri chromatograph mmiri nwere arụmọrụ dị elu (Acquity, Waters) mee nhicha ahụ na nyocha site na iji ihe nchọpụta nke nwere oke quadrupole (QDa, Acquity, Waters) n'okpuru otu ọnọdụ LC dị ka nyocha HPLC-MS/MS. A malitere nchịkọta nkewa mgbe achọpụtara m/z nke kwekọrọ na 3D20E22P n'otu oge nchekwa ahụ dịka e kpebiri na mbụ. E mechara lelee ịdị ọcha nke ihe ndị a wepụtara site na HPLC-MS/MS dịka akọwara n'elu.
E si na anụ ahụ ọmụmụ 10-12 ma ọ bụ akụkụ ahụ ndị ọzọ (enweghị isi) wepụta RNA site na iji TRI reagent (Thermo Fisher) dịka ntuziaka onye nrụpụta si dị. E jiri TURBO DNase (Thermo Fisher) gwọọ RNA. E ji Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (M-MLV RT; Thermo Fisher) mepụta cDNA dịka ntuziaka onye nrụpụta si dị. E bipụtara Primer-BLAST26 ma ọ bụ mepụta ya na mbụ24 ma ọ bụ jiri Primer-BLAST26, a na-enye mmasị na ngwaahịa nke 70-150 bp n'ogo na njikọ exon-exon ma ọ bụ Primer pair primers dị iche iche. E jiri ihe atụ cDNA site na ihe ndị e mere na bio replies atọ ruo anọ mee ihe ugboro anọ na mmiri maka RT-qPCR. E mere nhazi na mmeghachi omume 15 µl nwere 1 × PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), primers, na 5 µl nke cDNA a gwakọtara agwakọta. E tinyere mmeghachi omume na ya E jiri Nhazi na Nyocha (ụdị 2.4.3) chịkọta ma nyochaa sistemụ PCR QuantStudio 6 Pro na data. Dịka egosiri na ọmụmụ ihe a, e mere ka ọnụọgụgụ ndị metụtara ya dị ka mkpụrụ ndụ ihe nketa ribosomal RpL19 (AGAP004422), nke ọdịdị ya agbanweghị nke ukwuu mgbe e nyere ọbara 27 ma ọ bụ mgbe e tinyere ya na njikọ 3.
E jiri Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent) lelee ogo RNA. E kwadebere ma rụọ ọbá akwụkwọ Illumina na Broad Institute of MIT na Harvard. E jikọtara ọnụọgụgụ usoro na A. gambiae genome (PEST strain, version 4.12) site na iji HISAT2 (version 2.0.5) yana paramita ndabara. E wepụrụ akara agụ nwere ogo maapụ (MAPQ) <30 site na iji Samtools (version 1.3.1). E jiri htseq-count (version 0.9.1) gụọ ọnụọgụgụ agụ e kewara na mkpụrụ ndụ ihe nketa site na iji paramita ndabara. E gbakọọ ọnụọgụgụ agụ a na-ahazi ma nyochaa ngosipụta mkpụrụ ndụ ihe nketa dị iche site na iji ngwugwu DESeq2 (version 1.28.1) na R (version 4.0.3).
A chọpụtara ndị na-achọ mkpụrụ ndụ ihe nketa Ecdysone site na iji usoro PSI-BLAST (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/) chọọ mkpụrụ ndụ ihe nketa A. gambiae, site na iji ụkpụrụ ndabara. Parameters nwere usoro protein ajụjụ ndị a: site na Bombyx mori (Nọmba nnweta NP_001038956.1), Musca domestica (Nọmba nnweta XP_005182020.1, XP_005175332.1 na XP_011294434.1) na Microplitis demolitor (Nọmba nnweta XP_008552646.1 na XP_008552645.1) Eck sitere na B. mori (Nọmba nnweta NP_001036900), Drosophila melanogaster (Nọmba nnweta NP_651202), Apis mellifera (Nọmba Nweta XP_394838) na Acyrthosiphon pisum (Nọmba Nweta XP_001947166); na EPP sitere na B. mori (Nọmba Nweta XP_001947166) NP_001177919.1 na NP_001243996.1) na EO nke D. melanogaster (Nọmba Nweta NP_572986.1) (nzọụkwụ 1). Na-esote, ihe nzacha na-adaba dabere na mRNA dị elu (> iberibe 100/kilobase exons kwa nde agụ mapped mapped (FPKM) ma ọ bụ >85%) na anụ ahụ ọmụmụ (LRT ma ọ bụ MAG nwanyị) na Gambia (nzọụkwụ 2). Iji melite nkọwapụta, anyị họọrọ enzymes ndị a na-egosipụtakwa n'ime anụ ahụ ọmụmụ nke A. albimanus, ụdị anopheles nke na-anaghị emepụta ma ọ bụ bufee ecdysone n'oge mkpakọrịta nwoke na nwanyị. A na-enyocha mkpụrụ ndụ ihe nketa ndị a dabere na obere ngosipụta (<100 FPKM ma ọ bụ <85th percentile) na anụ ahụ ọmụmụ nke A. albimanus (nzọụkwụ 3). Dịka nzacha ikpeazụ (nzọụkwụ 4), mkpụrụ ndụ ihe nketa ndị a kwesịrị imeju ma ọ dịkarịa ala otu n'ime ihe ndị a: (1) achịkwa nke ukwuu mgbe njikọta (P < 0.05) dịka nyocha nke mkpụrụ ndụ ihe nketa ndị a na-egosipụta dị iche iche na (2) na anụ ahụ na-abụghị ọmụmụ (< 85% ma ọ bụ <100 FPKM).
Anyị gbanwere ụzọ ndị e kọwara na mbụ 28,29,30 iji nweta akara isotopic zuru oke nke ihe dị ndụ. N'ụzọ dị mkpirikpi, a nwalere ụdị Saccharomyces cerevisiae nke ụdị II (YSC2, Sigma) na yist nitrogen base (BD Difco, DF0335) nke nwere (wt/vol) 2% glucose (G7528, Sigma), 1.7% amino acid-free na ammonium sulfate. culture medium) na 5% 15N ammonium sulfate (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories) dị ka naanị isi iyi nitrogen. A chọtara yist site na centrifugation ma nye ụmụ ahụhụ anwụnta nri ad libitum ruo mgbe ha toro. A na-agbakwunye ya na anụ azụ (0.5 mg kwa ụmụ ahụhụ 300) iji gbochie ọnwụ nke anọ nke ụmụ nwanyị. Naanị ụmụ nwanyị ka e jiri mee nnwale njikọta na ụmụ nwoke na-enweghị akara iji nyochaa proteome nwoke ebufere n'oge njikọta.
A manyere ụmụ nwanyị dị afọ 4-6, ndị nwere akara 15N, ndị nwere akara afọ 15, ka ha na ụmụ nwoke na-amaghị nwoke nke afọ ha na-akpakọrịta. E gosipụtara njikọ ahụ nke ọma site n'ịchọpụta ihe nkwụnye njikọ site na iji microscopy epifluorescence. Na 3, 12, na 24 hpm, a kewara atria nke ụmụ nwanyị nwere akara afọ 45-55 n'ime 50 µl nke ammonium bicarbonate buffer (pH 7.8) ma jiri pestle mee ka ọ dị ka otu. A kụnyere homogenate ahụ ma gwakọta ihe karịrị ya na 50 µl nke 0.1% RapiGest (186001860, Waters) na 50 mM ammonium bicarbonate. A kpọchiri ihe karịrị ya na pellet sitere na ihe nlele ọ bụla na ice kpọrọ nkụ ma ziga ya n'abalị gaa na ụlọ nyocha MacCoss na Mahadum Washington, ebe emechara nkwadebe ihe nlele maka LC-MS/MS. Tinyeghachi pellet ahụ na 50 µl nke 0.1% RapiGest na 50 mM ammonium bicarbonate na sonicate n'ime mmiri ịsa ahụ. E jiri nyocha BCA tụọ oke protein nke pellet na supernatant, e belatara ihe nlele ahụ na dithiothreitol 5 mM (DTT; Sigma), alkylated ya na 15 mM iodoacetamide (Sigma) ma tinye ya na 37 °C (1:0 50) maka otu awa na trypsinization: trypsin:substrate ratio). E tinyere RapiGest 200 mM HCl, wee tinye ya na 37 °C maka nkeji iri anọ na ise na centrifugation na 14,000 rpm maka nkeji iri na 4 °C iji wepụ ihe ndị a. E jiri mwepụ nke usoro siri ike abụọ (katrij Oasis MCX, Mmiri) sachaa ihe nlele ndị a ma weghachite ha na 0.1% formic acid maka mkpokọta protein ikpeazụ nke 0.33 µg µl-1. E nyochakwara proteomes MAG na-enweghị aha n'otu aka ahụ site na ụmụ nwoke na-amaghị nwoke. Abụọ E nyochachara ihe ndị e ji eme nyocha maka ihe nlele ọ bụla. Mgbe nke ahụ gasịrị, e jiri kọlụm silica fused 75-μm nke dị sentimita 25 n'obosara, nke nwere ọnyà frit silica Kasil1 (PQ) nke dị sentimita 4 n'obosara, nke nwere resin Jupiter C12 reversed-phase (Phenomenex) na chromatography mmiri mmiri nke nkeji 180, nyochaa 1 µg nke ọ bụla. Ndekọ ihe atụ - Ejiri usoro Q-Exactive HF mass spectrometer (Thermo Fisher) na sistemụ nanoACQUITY UPLC (Waters) mee MS/MS. A gbanwere data nnweta metụtara data nke e mepụtara maka ọsọ ọ bụla gaa na usoro mzML site na iji Proteowizard (ụdị 3.0.20287) ma jiri Comet31 (ụdị 3.2) megide nchekwa data FASTA nwere usoro protein sitere na Anopheles gambiae (ụdị VectorBase 54), Anopheles coluzzi. A mere nchọpụta na Mali-NIH (ụdị VectorBase 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, Maachị 2021), A. gambiae RNA-seq, na ntụgharị atọ nke ihe ndị a maara na mmadụ. Ejiri Percolator32 (ụdị 3.05) chọpụta FDR ndị kwekọrọ na maapụ Peptide na oke 0.01, a chịkọtakwara peptides n'ime njirimara protein site na iji protein parsimony na Limelight33. (ụdị 2.2.0). E mere atụmatụ mmụba protein dị n'etiti site na iji ihe a na-akpọ normalized spectral multiple factor (NSAF) nke a gbakọrọ maka protein ọ bụla n'ọsọ ọ bụla dịka akọwara na mbụ. E jiri ihe a na-akpọ NSAF tụnyere protein ọ bụla mee ihe n'ofe ihe atụ sitere na ihe abụọ dị iche iche dị na bayọlọji. 15N labeling kpuchiri proteome nwanyị nke ọma, ọ bụ ezie na enwere ike ịchọpụta obere protein a na-akpọghị aha site na virgins ndị a kpọrọ aha. Anyị dekọrọ nchọpụta nke mbelata protein nwoke (1-5 spectra) na ihe atụ ndị dị n'ime ụmụ nwanyị naanị na usoro teknụzụ, ebe a na-agba ihe atụ ndị dị n'ime mgbe ihe atụ ndị nwoke/mmekọ nwoke na nwanyị gasịrị, n'ihi "ibufe" HPLC. A na-edepụta protein ndị a na-achọta dị ka 'ihe ruru unyi' site na virgins ndị a kpọrọ aha na Tebụl Mgbakwunye 1.
Peptides antigenic abụọ, QTTDRVAPAPDQQQ (n'ime isotype PA) na MESDGTTPSGDSEQ (n'ime isotype PA na PB) na Genscript. E jikọtara peptides abụọ ahụ, wee jikọta ha na protein KLH ma gbanye ha n'ime oke bekee New Zealand. E jiri oke bekee chụọ àjà mgbe agba nke anọ gasịrị, e kewapụkwara IgG zuru oke site na nhicha affinity. E jiri IgG sitere na oke bekee EPP kacha akọwapụta maka igbochi ọdịda anyanwụ ọzọ.
Maka ihe ndị dị n'ebe ọdịda anyanwụ, MAG (n = 10, ebe n na-anọchite anya ọnụọgụ nke ihe nlele anwụnta na-adabereghị na ihe ndị dị ndụ) na LRT nwanyị (n = 30) sitere na ụmụ nwoke dị ụbọchị anọ na ụmụ nwanyị na-amaghị nwoke ma ọ bụ ndị a manyere aka (<10 mgbe ha metụrụ), ihe nchekwa protein (50 mM Tris, pH 8.0; 1% NP-40; 0.25% sodium deoxycholate; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1 × protease inhibitor cocktail (Roche)) ka etinyere ihe nlele ahụ iche iche. E jiri beader (2 mm iko beads, 2,400 rpm, 90 sec) kewaa ihe ndị na-anaghị agbaze agbaze. E wepụrụ ihe ndị na-anaghị agbaze agbaze site na centrifugation na 20,000 g na 4 °C. E jiri Bradford assay (Bio-Rad) tụọ protein ndị ahụ. Mgbe ahụ, 20 µg nke protein MAG, 40 µg nke protein LRT, na 20 µg nke E jiri MOPS buffer kewaa protein fọdụrụnụ ma kewaa ya site na 10% Bis-Tris NuPAGE. E zigara protein ndị ahụ na akpụkpọ ahụ fluoride polyvinylidene site na iji sistemụ nnyefe iBlot2 (Thermo Fisher). E sachara akpụkpọ ahụ ugboro abụọ na 1 × PBS-T (0.1% Tween-20 na PBS) wee gbochie ya na Odyssey blocking buffer (Li-Cor) maka otu awa na 22°C. E fegharịrị akpụkpọ ahụ n'abalị na 4°C site na iji rabbit anti-EPP polyclonal primary antibody (1:700 na blocking buffer) na rat anti-actin monoclonal primary antibody MAC237 (Abeam; 1:4,000). E ji PBS-T sachaa akpụkpọ ahụ wee tinye ọgwụ mgbochi nke abụọ (donkey anti-rabbit 800CW na goat anti-rat 680LT (Li-Cor), ha abụọ bụ 1:20,000) na blocking buffer nke nwere 0.01% SDS na 0.2% Tween -20 ruo otu awa na okpomọkụ 22 Celsius. E ji PBS-T saa akpụkpọ ahụ ma jiri ihe nyocha Odyssey CLx see foto. E chịkọtara ma hazie foto ndị ahụ na Image Studio (ụdị 5.2). Achọpụtaghị otu eriri kpọmkwem nke kwekọrọ na isoform EPP-RA (82 kDa).
E tinyere mpaghara koodu nke EPP (dịka isoform AGAP002463-RB nke nwere ngalaba histidine phosphatase, nchọta ngalaba NCBI nke echekwara 34) na Eck2 (AGAP002181) n'ime plasmid pET-21a(+) (Novagen Millipore Sigma); E depụtara ihe ndị e ji praịmarị mee na Tebụl Data Extended 2. E tinyere njikọ GS4 asatọ (n'otu aka) tupu C-terminal 6xHis tag nke pET-21a(+)-EcK2 construct. E mepụtara protein ndị e ji emegharị ahụ site na iji mmeghachi omume protein E. coli nke na-enweghị sel (New England BioLabs) nke NEBExpress. E jiri kọlụm NEBExpress Ni spin (New England BioLabs) mee ka protein ndị e ji emegharị ahụ dị ọcha. E ji template DNA nke NEBExpress Cell-Free E. coli Protein Synthesis Kit mepụta protein njikwa Dihydrofolate (DHFR). E debere protein ndị a na glycerol 50% na PBS na -20 °C ruo ọnwa atọ.
E jiri 4-nitrophenyl phosphate (pNPP; Sigma-Aldrich) tụọ ọrụ phosphotase nke EPP na ihe ndị e si na anụ ahụ wepụta. Ihe nchekwa mmeghachi omume ahụ nwere 25 mM Tris, 50 mM acetic acid, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, na 1 mM DTT. E tinyere anụ ahụ n'otu n'otu na ihe nchekwa mmeghachi omume ma wepụ ihe mkpofu sel site na centrifugation. Malite mmeghachi omume ahụ site na ịgbakwunye enzyme ma ọ bụ ihe mwepụ anụ ahụ na ihe nchekwa mmeghachi omume nke nwere 2.5 mg ml-1 pNPP. E tinyere ngwakọta mmeghachi omume ahụ n'ime okpomọkụ ụlọ n'ọchịchịrị, a tụkwara ọnụọgụ pNP agbanwere site na pNPP site na ịtụ nnabata na 405 nm n'oge dị iche iche.
Maka ọrụ Eck in vitro, e tinyere 0.2 mg 20E ma ọ bụ 3D20E na protein ahụ na 200 µl buffer (pH 7.5) nke nwere 10 mM HEPES–NaOH, 0.1% BSA, 2 mM ATP na 10 mM MgCl2 ruo awa 2 na 27 °C. A kwụsịrị mmeghachi omume ahụ site na ịgbakwunye 800 µl methanol, wee jụọ oyi na -20 °C maka otu awa, wee tinye centrifuge na 20,000 g maka nkeji 10 na 4 °C. HPLC-MS/MS wee nyochaa ihe na-ekpo ọkụ ahụ. Iji kpoo protein ndị ejiri na otu njikwa ahụ ọkụ, e tinyere protein ndị ahụ na 50% glycerol na PBS maka nkeji 20 na 95 °C.
Maka ọrụ EPP in vitro, e tinyere 3D20E22P (nke kwekọrọ na ọnụọgụ dị na MAG 18, nke HPLC-MS/MS sachara) na 100 µl buffer (pH 7.5) nke nwere 25 mM Tris, 50 mM acetic acid, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, na 1 mM DTT ruo awa 3 na 27 °C. A kwụsịrị mmeghachi omume ahụ site na ịgbakwunye 400 µl methanol ma jụọ oyi na -20 °C maka otu awa, wee tinye centrifuge na 20,000 g maka nkeji 10 na 4 °C. HPLC-MS/MS nyochachara ihe na-ekpo ọkụ ahụ.
E si na cDNA nke e ji ihe ndị anwụnta na-anaghị akpata isi mee ka iberibe PCR maka EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) na EcK2 (556 bp) mụbaa site na cDNA e ji ihe ndị anwụnta na-anaghị akpata isi mee ka ha dịkwuo mma. E si na pCR2.1-eGFP nke e kwuru na mbụ mee ka iberibe PCR nke eGFP (495 bp) dịkwuo elu; E depụtara ihe ngosi PCR na Tebụl Data Extended 2. E tinyere iberibe PCR n'etiti ndị na-akwalite T7 a tụgharịrị na plasmid pL4440. E nwetara ihe owuwu Plasmid site na NEB 5-α nke nwere ikike E. coli (New England Biolabs) ma nyochaa ya site na usoro DNA tupu ejiri ya (lee Data Mgbakwunye 1 maka usoro ntinye). E jiri ihe ngosi dakọtara na onye na-akwalite T7 (Tebụl Data Extended 2) mee ka ihe ntinye ahụ dịkwuo elu site na plasmid nke dabere na pL4440. E gosipụtara nha ngwaahịa PCR site na agarose gel electrophoresis. E degharịrị dsRNA site na ndebiri PCR site na iji Megascript T7 Transcription Kit (Thermo Fisher) ma sachaa ya dịka ntuziaka onye nrụpụta si dị na mgbanwe ndị akọwara na mbụ.
Maka ịgba ọgwụ dsRNA, a gbara 1,380 ng nke dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) na mkpokọta 10 ng nl-1 n'ime úkwù nke ụmụ nwoke ma ọ bụ ụmụ nwanyị toro eto (Nanoject III, Drummond) n'ime ụbọchị 1 mgbe e kpuchisịrị ya. A chọpụtara ọkwa mbelata mkpụrụ ndụ ihe nketa na opekata mpe ihe atọ sitere na ihe ndị dị ndụ site na mwepụta RNA, njikọ cDNA, na RT-qPCR. Maka ịgba ọgwụ ecdysone, a gbara ụmụ nwanyị dị ụbọchị 4 na-amaghị nwoke ma ọ bụ nwanyị dị ụbọchị 6 na-aṅụ ọbara 0.13, 0.21, ma ọ bụ 0.63 µg nke 20E ma ọ bụ 3D20E (Nanoject III, Drummond) na mkpokọta nke 1.3, 2.1, n'otu n'otu, dabere na nhazi nnwale ma ọ bụ 6.3 ng nl-1. Tinye 100 nl nke 10% (vol/vol) ethanol n'ime mmiri; 100 nl nke 3D20E22P na 10% ethanol (ihe ruru 75% nke ego a hụrụ na MAG abụọ). E kenyere anwụnta n'ime otu ọgwụ ahụ n'enweghị usoro.
Maka nnwale ọmụmụ nwa, a na-enye ụmụ nwanyị dị ụbọchị atọ nri ad libitum na ọbara mmadụ. Wepụ anwụnta a na-enye akụkụ ụfọdụ ma ọ bụ nke a na-enyeghị nri. Dabere na ọgwụgwọ ahụ, a na-etinye ụmụ nwanyị n'ime iko ịmụ nwa dị iche iche ruo abalị anọ ma ọ dịkarịa ala awa 48 mgbe e risịrị nri ọbara. A na-agụ àkwá n'okpuru stereoscope (Stemi 508, Zeiss); maka ụmụ nwanyị a lụrụ di, a na-ewere àkwá ndị gbapụtara n'ime ụmụ ahụhụ dị ka ndị na-eme nri.
Maka nnwale mmekọ nwoke na nwanyị, a na-ahapụ ụmụ nwanyị ka ha nọrọ ụbọchị abụọ ma ọ dịkarịa ala dabere na ọgwụgwọ ahụ iji nwee ike iguzogide mkpakọrịta nwoke na nwanyị, e mesịkwara tinye ụmụ nwoke ndị dị afọ iri na otu n'ime otu ụlọ mkpọrọ ahụ. Abalị abụọ ka e mesịrị, a gbubiri vesicles nke ụmụ nwanyị e tinyere n'ime ya ma wepụta DNA genomic site na friza-thaw na sonication n'ime ihe nchekwa nwere 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, na 25 mM NaCl (pH 8.2). E tinyere Proteinase K (0.86 µg µl-1) n'ime ihe nlele ahụ ruo nkeji iri na ise na 55 °C, wee soro ya nkeji iri na 95 °C. E gwakọtara nkwadebe DNA genomic dị ụkọ ugboro iri ma mee ka ọ chọpụta qPCR nke usoro chromosome Y; edepụtara praịma na Tebụl Data Gbatịpụrụ 2. Enweghị usoro chromosome Y na-egosi enweghị njikọ.
Maka nnwale njikọta ọzọ, a lere ụmụ nwanyị ejiri ike mee ihe anya maka ọnụnọ nke plọg njikọta iji gosi na ha nwere ọnọdụ njikọta ma nye ha ohere ụbọchị abụọ ka ha nwee ike ịgbanwe mmekọrịta ma ọ bụrụ na ha enweghị ụmụ nwoke, dịka akọwara na mbụ 36. E wee tinye ụmụ nwoke ndị bu sperm transgenic DsRed n'ime ụlọ ndị inyom. Abalị abụọ ka nke ahụ gasịrị, a kewara vesicles ndị na-eme fatịlaịza site na ụmụ nwanyị, e wee kwadebe DNA genomic dịka akọwara n'elu ma mee ka a chọpụta qPCR nke transgene DsRed; edepụtara primers na Tebụl Data Gbatịpụrụ 2. Enweghị transgene DsRed gosiri na ọ dịghị njikọ ọzọ mere.
A kpụpụtara 3D20E dịka e si kọwaa ya na mbụ 37. N'ụzọ dị mkpirikpi, a gbazere 10 mg nke 20E (Sigma-Aldrich) na 10 ml nke mmiri, wee tinye 30 mg nke platinum ojii (n'ụdị ntụ ntụ, Sigma-Aldrich). A na-agbagharị mmiri dị nro nke O2 n'ime ngwakọta mmeghachi omume ahụ mgbe niile, nke a na-akpali na okpomọkụ ụlọ. Mgbe awa isii gachara, etinyere 30 mL nke methanol iji kwụsị mmeghachi omume ahụ. A na-etinye ngwakọta ahụ na centrifuge iji wepụ ihe ndị na-akpali akpali. A na-ekpochapụ ihe na-ekpo ọkụ ahụ ka ọ kpọọ nkụ na vacuo na okpomọkụ ụlọ. A gbazere ngwaahịa mmeghachi omume kpọrọ nkụ na 10% ethanol na methanol maka ịgba ọgwụ maka nyocha HPLC-MS/MS. Ọnụego mgbanwe (site na 20E ruo 3D20E) dị ihe dị ka 97% (Foto 4b), na ụdị MS nke 3D20E emepụtara dakọtara nke a hụrụ na ụmụ nwanyị ndị lụrụ di na nwunye (Foto 4c).
Akụkọ ihe mere eme ahụ nwere nkọwa kpọmkwem nke ule ọnụọgụgụ emere. E jiri GraphPad (ụdị 9.0) mee ule Fisher kpọmkwem, ule Mantel-Cox, na ule t nke nwa akwụkwọ. E jiri edemede R omenala mee ule Cochran-Mantel-Haenszel. E jiri ule Shapiro-Wilk mee ule nkịtị yana oke mkpa nke 0.05. Mgbe data ahụ dara ule nkịtị, e mere ule Mann-Whitney. E jiri ule Mantel-Cox nyochaa data lanarị. E jiri ngwugwu DESeq2 (ụdị 1.28.1) mee nyocha ngosipụta dị iche iche nke ọkwa mkpụrụ ndụ RNA-seq. Ogwe kwụ ọtọ na eserese ahụ na-anọchite anya etiti. E jiri uru dị mkpa nke P = 0.05 mee ihe dị ka oke maka ule niile.
Maka ozi ndị ọzọ gbasara nhazi ọmụmụ ihe a, lee nchịkọta akụkọ gbasara Nature Research Report nke jikọtara na akụkọ a.
E tinyere data MS proteomic n'ime ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) site na PRIDE Partner Repository (https://www.ebi.ac.uk/pride/) yana njirimara data PXD032157.
A na-etinye dataset RNA-seq n'ime Gene Expression Comprehensive Library (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) n'okpuru ndekọ usoro GSE198665.
Enwere ike ịnweta data ndị ọzọ e mepụtara ma ọ bụ nyochaa n'oge ọmụmụ ihe a site n'aka ndị edemede kwekọrọ na ya mgbe a rịọrọ ya nke ọma. Edemede a na-enye data isi mmalite.
De Loof, A. Ecdysteroids: Steroids ụmụ ahụhụ a na-eleghara anya? Nwoke: Igbe Ojii. Sayensị Ụmụ ahụhụ.13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-hydroxyecdysone na mmepe nke ovaries na Anopheles stephens.J. Ahụhụ Physiology.28, 97–109 (1982).