Metabolites immunomodulatory bụ isi ihe dị mkpa na gburugburu ebe obibi tumor (TME), mana ewezuga ole na ole, njirimara ha ka bụ ihe a na-amaghị nke ọma. N'ebe a, anyị nyochachara etuto ahụ na mkpụrụ ndụ T site na etuto ahụ na ascites nke ndị ọrịa nwere nnukwu serous carcinoma (HGSC) iji kpughee metabolome nke akụkụ TME dị iche iche ndị a. Ascites na mkpụrụ ndụ tumor nwere nnukwu ọdịiche metabolite. Ma e jiri ya tụnyere ascites, mkpụrụ ndụ T ndị na-abanye na tumor na-amụba nke ukwuu na 1-methylnicotinamide (MNA). Ọ bụ ezie na ọkwa MNA dị elu na mkpụrụ ndụ T, ngosipụta nke nicotinamide N-methyltransferase (enzyme nke na-akwalite mbufe nke otu methyl site na S-adenosylmethionine gaa na nicotinamide) bụ naanị na fibroblasts na mkpụrụ ndụ tumor. N'ọrụ, MNA na-akpali mkpụrụ ndụ T ka ha wepụta cytokine tumor necrosis factor alpha nke na-akwalite tumor. Ya mere, MNA sitere na TME na-enye aka na nhazi ahụ ike nke mkpụrụ ndụ T ma na-anọchite anya ihe mgbaru ọsọ immunotherapy nwere ike maka ọgwụgwọ nke ọrịa kansa mmadụ.
Mkpụrụ ndụ ihe nketa sitere na tumor nwere ike inwe mmetụta dị ukwuu na mgbochi ọrịa kansa, ọtụtụ ihe akaebe na-egosikwa na ha nwekwara ike ịbụ isi ihe na-akpali ọrịa (1). Na mgbakwunye na mmetụta Warburg, ọrụ ndị na-adịbeghị anya amalitela ịkọwa ọnọdụ metabolic nke mkpụrụ ndụ ihe nketa na mmekọrịta ya na ọnọdụ mgbochi ọrịa nke gburugburu ebe obibi tumor (TME). Ọmụmụ ihe na ụdị òké na mkpụrụ ndụ T mmadụ egosila na metabolism glutamine (2), metabolism oxidative (3) na metabolism glucose (4) nwere ike ịrụ ọrụ n'adabereghị onwe ha na obere otu mkpụrụ ndụ ihe nketa dị iche iche. Ọtụtụ metabolites na ụzọ ndị a na-egbochi ọrụ mgbochi ọrịa nke mkpụrụ ndụ T. A chọpụtala na mgbochi nke coenzyme tetrahydrobiopterin (BH4) nwere ike imebi mmụba nke mkpụrụ ndụ T, mmụba nke BH4 n'ahụ nwere ike ime ka nzaghachi mgbochi ọrịa kansa nke CD4 na CD8 na-akwado. Na mgbakwunye, enwere ike ịzọpụta mmetụta immunosuppressive nke kynurenine site na inye BH4 (5). N'ime mgbanwe isocitrate dehydrogenase (IDH) glioblastoma, mmepụta nke enantiometabolic (R)-2-hydroxyglutarate (R-2-HG) na-egbochi mmegharị, mmụba na ọrụ cytolysis nke mkpụrụ ndụ T (6). N'oge na-adịbeghị anya, egosila na methylglyoxal, ihe sitere na glycolysis, na-emepụta site na mkpụrụ ndụ mgbochi nke sitere na myeloid, na nnyefe mkpụrụ ndụ T nke methylglyoxal nwere ike igbochi ọrụ mkpụrụ ndụ T effector. Na ọgwụgwọ, mwepụ nke methylglyoxal nwere ike imeri ọrụ nke mkpụrụ ndụ mgbochi myeloid (MDSC) ma melite ọgwụgwọ mgbochi ebe a na-enyocha ihe na ụdị òké (7). Ọmụmụ ihe ndị a na-emesi ike ọrụ dị mkpa nke metabolites sitere na TME na ịchịkwa ọrụ na ọrụ nke mkpụrụ ndụ T.
A kọwapụtala ọtụtụ ihe gbasara nsogbu mkpụrụ ndụ T n'ọrịa kansa ovarian (8). Nke a bụ n'ihi njirimara metabolic dị n'ime hypoxia na akwara etuto ahụ na-adịghị mma (9), nke na-eme ka glucose na tryptophan ghọọ ihe ndị sitere na ya dịka lactic acid na kynurenine. Oke lactate extracellular na-ebelata mmepụta nke interferon-γ (IFN-γ) ma na-akwalite ọdịiche nke obere myelosuppressive (10, 11). Oriri nke tryptophan na-egbochi mgbasa nke mkpụrụ ndụ T ozugbo ma na-egbochi akara nnabata mkpụrụ ndụ T (12-14). N'agbanyeghị ihe ndị a hụrụ, e mere ọtụtụ ọrụ gbasara metabolism ahụ ji alụso ọrịa ọgụ na in vitro T cell site na iji usoro mgbasa ozi kachasị mma, ma ọ bụ naanị na ụdị òké homologous na vivo, nke ọ bụla n'ime ha na-egosipụta nke ọma ọdịiche nke ọrịa kansa mmadụ na gburugburu ebe obibi Physiological macro na micro.
Ihe a na-ahụkarị na kansa ovarian bụ mgbasa nke peritoneal na ọdịdị nke ascites. Mkpokọta mmiri mkpụrụ ndụ na ascites na-ejikọta ya na ọrịa dị elu na enweghị amụma (15). Dịka akụkọ si kwuo, akụkụ pụrụ iche a bụ hypoxic, nwere nnukwu ọkwa nke ihe na-eto eto endothelial vascular (VEGF) na indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), a na-abanyekwa ya site na mkpụrụ ndụ T na mkpụrụ ndụ mgbochi myeloid (15-18). Gburugburu metabolism nke ascites nwere ike ịdị iche na nke etuto ahụ n'onwe ya, yabụ nhazigharị nke mkpụrụ ndụ T n'ime oghere peritoneal edoghị anya. Na mgbakwunye, ọdịiche dị mkpa na ọdịiche dị n'etiti ascites na metabolites dị na gburugburu etuto ahụ nwere ike igbochi ịbanye nke mkpụrụ ndụ ahụ ji alụso ọrịa ọgụ na ọrụ ha na etuto ahụ, a chọkwara nyocha ọzọ.
Iji dozie nsogbu ndị a, anyị mepụtara usoro nkewa sel dị nro na usoro chromatography mmiri mmiri (tandem mass spectrometry) (LC-MS/MS) iji mụọ ụdị sel dị iche iche (gụnyere mkpụrụ ndụ CD4 + na CD8 + T) yana n'ime na n'etiti etuto ahụ. Metabolites ya na-agbasa mkpụrụ ndụ n'otu ascites na gburugburu etuto ahụ nke onye ọrịa. Anyị na-eji usoro a na njikọ cytometry mmiri dị elu na usoro RNA otu mkpụrụ ndụ (scRNA-seq) iji nye nkọwa doro anya nke ọnọdụ metabolic nke ndị a dị mkpa. Usoro a kpughere mmụba dị ukwuu na ọkwa nke 1-methylnicotinamide (MNA) na mkpụrụ ndụ tumor T, nnwale in vitro gosiri na mmetụta immunomodulatory nke MNA na ọrụ mkpụrụ ndụ T amabeghị na mbụ. N'ozuzu, usoro a na-ekpughe mmekọrịta metabolic dị n'etiti etuto ahụ na mkpụrụ ndụ ji alụso ọrịa ọgụ, ma na-enye nghọta pụrụ iche na metabolites njikwa mgbochi ọrịa, nke nwere ike ịba uru maka ọgwụgwọ nke T cell-based cancer cancer immunotherapy ohere ọgwụgwọ.
Anyị jiri cytometry mmiri dị elu iji tụọ nnabata glucose n'otu oge [2-(N-(7-nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG) na ọrụ mitochondrial [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) bụ ihe nrịbama ndị a na-ahụkarị n'akụkụ nke na-amata mkpụrụ ndụ ji alụso ọrịa ọgụ na ọnụọgụ mkpụrụ ndụ tumor (Tebụl S2 na Foto S1A). Nyocha a gosiri na ma e jiri ya tụnyere mkpụrụ ndụ T, ascites na mkpụrụ ndụ tumor nwere ọkwa nnabata glucose dị elu, mana ha nwere obere ọdịiche na ọrụ mitochondrial. Nkezi nnabata glucose nke mkpụrụ ndụ tumor [CD45-EpCAM (EpCAM)+] bụ okpukpu atọ ruo anọ nke mkpụrụ ndụ T, nkezi nnabata glucose nke mkpụrụ ndụ CD4 + T bụ ugboro 1.2 nke mkpụrụ ndụ CD8 + T, nke na-egosi na lymphocytes Tumor infiltrating (TIL) nwere ihe dị iche iche achọrọ na metabolic ọbụlagodi na otu TME (Foto 1A). N'ụzọ dị iche, ọrụ mitochondrial na mkpụrụ ndụ tumor yiri nke mkpụrụ ndụ CD4 + T, ọrụ mitochondrial nke ụdị mkpụrụ ndụ abụọ ahụ dịkwa elu karịa nke mkpụrụ ndụ CD8 + T (Foto 1B). N'ozuzu, nsonaazụ ndị a na-ekpughe ọkwa metabolic. Ọrụ metabolic nke mkpụrụ ndụ tumor dị elu karịa nke mkpụrụ ndụ CD4 + T, ọrụ metabolic nke mkpụrụ ndụ CD4 + T dị elu karịa nke mkpụrụ ndụ CD8 + T. N'agbanyeghị mmetụta ndị a n'ofe ụdị mkpụrụ ndụ, enweghị ọdịiche na-adịgide adịgide na ọnọdụ metabolic nke mkpụrụ ndụ CD4 + na CD8 + T ma ọ bụ oke ha na ascites ma e jiri ya tụnyere etuto ahụ (Foto 1C). N'ụzọ dị iche, na akụkụ mkpụrụ ndụ CD45, oke nke mkpụrụ ndụ EpCAM+ na etuto ahụ mụbara ma e jiri ya tụnyere ascites (Foto 1D). Anyị hụkwara ọdịiche metabolic doro anya n'etiti akụkụ EpCAM+ na EpCAM-cell. Mkpụrụ ndụ EpCAM+ (tumor) nwere oke glucose na ọrụ mitochondrial karịa mkpụrụ ndụ EpCAM-, nke dị elu karịa ọrụ metabolic nke fibroblasts na mkpụrụ ndụ tumor na TME (Foto 1, E na F).
(A na B) Ike ọkụ eletrik etiti (MFI) nke nnabata glucose (2-NBDG) (A) na ọrụ mitochondrial nke mkpụrụ ndụ CD4 + T (MitoTracker ọbara ọbara gbara ọchịchịrị) (B) Grafụ ndị nnọchi anya (aka ekpe) na data e depụtara (Aka nri), mkpụrụ ndụ CD8 + T na mkpụrụ ndụ EpCAM + CD45-tumor sitere na ascites na tumor. (C) Oke nke mkpụrụ ndụ CD4 + na CD8 + (nke mkpụrụ ndụ CD3 + T) na ascites na tumor. (D) Oke nke mkpụrụ ndụ EpCAM + tumor na ascites na tumor (CD45−). (E na F) EpCAM + CD45-tumor na EpCAM-CD45-matrix glucose uptake (2-NBDG) (E) na ọrụ mitochondrial (MitoTracker ọbara ọbara gbara ọchịchịrị) (F) eserese ndị nnọchiteanya (aka ekpe) na data e depụtara (Aka nri) Ascites na mkpụrụ ndụ tumor. (G) Grafụ ndị nnọchi anya nke ngosipụta CD25, CD137 na PD1 site na cytometry flow. (H na I) ngosipụta CD25, CD137 na PD1 na mkpụrụ ndụ CD4 + T (H) na mkpụrụ ndụ CD8 + T (I). (J na K) Ụdị ihe ncheta dị iche iche nke Naive, Central Memory (Tcm), Effector (Teff) na Effector Memory (Tem) dabere na ngosipụta nke CCR7 na CD45RO. Foto ndị a na-anọchite anya (aka ekpe) na data tabular (nri) nke mkpụrụ ndụ CD4 + T (J) na mkpụrụ ndụ CD8 + T (K) na ascites na etuto ahụ. Ụkpụrụ P nke a na-ejikọta ọnụ kpebiri site na ule t (*P<0.05, **P<0.01 na ***P<0.001). Ahịrị ahụ na-anọchite anya ndị ọrịa dakọtara (n = 6). FMO, fluorescence na-ebelata otu; MFI, ike fluorescence etiti.
Nnyocha ndị ọzọ gosiri ọdịiche dị mkpa dị n'etiti ọnọdụ mkpụrụ ndụ T nke edoziri nke ọma. Ọrụ (Foto 1, G ruo I) na ebe nchekwa ihe mmetụta (Foto 1, J na K) na etuto ahụ na-adịkarị karịa ascites (oke nke mkpụrụ ndụ CD3 + T). N'otu aka ahụ, inyocha ụdị ihe mmetụta ahụ site na ngosipụta nke ihe nrịbama mkpali (CD25 na CD137) na ihe nrịbama mbelata [protein ọnwụ mkpụrụ ndụ emebere 1 (PD1)] gosiri na ọ bụ ezie na njirimara metabolic nke ndị a dị iche (Foto S1, B ruo E), Mana ọ dịghị ọdịiche metabolic dị mkpa a hụrụ mgbe niile n'etiti obere, onye na-eme ihe mmetụta ma ọ bụ ebe nchekwa (Foto S1, F ruo I). E kwadoro nsonaazụ ndị a site na iji usoro mmụta igwe iji kenye ụdị mkpụrụ ndụ na-akpaghị aka (21), nke kpughekwara ọnụnọ nke ọtụtụ mkpụrụ ndụ ọkpụkpụ (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) na ascites nke onye ọrịa (Foto S2A). N'ime ụdị mkpụrụ ndụ niile achọpụtara, ọnụọgụ mkpụrụ ndụ myeloid a gosipụtara oke nnabata glucose na ọrụ mitochondrial (Foto S2, B ruo G). Nsonaazụ ndị a na-egosi ọdịiche siri ike nke metabolic dị n'etiti ọtụtụ ụdị mkpụrụ ndụ dị na ascites na etuto ahụ na ndị ọrịa HGSC.
Isi ihe ịma aka dị na nghọta nke njirimara metabonomic nke TIL bụ mkpa ọ dị ịchọpụta ihe nlele mkpụrụ ndụ T nke dị ọcha, mma na ọnụọgụ zuru oke site na etuto ahụ. Ọmụmụ ihe ndị e mere n'oge na-adịbeghị anya egosila na usoro nhazi na ime ka bead bawanye dabere na cytometry flow nwere ike ibute mgbanwe na profaịlụ metabolite cellular (22-24). Iji merie nsogbu a, anyị mere ka usoro ime ka bead bawanye mma iji kewapụ ma kewapụ TIL site na kansa ovarian mmadụ ewepụrụ site na ịwa ahụ tupu nyocha site na LC-MS/MS (lee Ihe na Usoro; Foto 2A). Iji nyochaa mmetụta zuru oke nke usoro a na mgbanwe metabolite, anyị tụnyere profaịlụ metabolite nke mkpụrụ ndụ T nke ndị na-enye onyinye ahụike na-arụ ọrụ mgbe usoro nkewa bead dị n'elu gasịrị na mkpụrụ ndụ ndị na-ekewaghị bead mana ha nọgidere na ice. Nyocha njikwa mma a chọpụtara na enwere njikọ dị elu n'etiti ọnọdụ abụọ a (r = 0.77), na imeghachi teknụzụ nke otu metabolites 86 nwere ike imeghachi ihe dị elu (Foto 2B). Ya mere, ụzọ ndị a nwere ike ime nyocha metabolite ziri ezi na mkpụrụ ndụ ndị na-eme ka mkpụrụ ndụ dịkwuo mma, si otú a na-enye ikpo okwu mbụ dị elu maka ịchọpụta metabolites kpọmkwem na HGSC, si otú a na-enyere ndị mmadụ aka ịghọta nke ọma gbasara nkọwapụta sel mmemme metabolism mmekọahụ.
(A) Ihe osise eserese nke mmụba mkpụrụ osisi magnetik. Tupu nyocha site na LC-MS/MS, mkpụrụ ndụ ga-agafe agba atọ n'usoro nke mmụba mkpụrụ osisi magnetik ma ọ bụ nọgide na ice. (B) Mmetụta nke ụdị mmụba mkpụrụ osisi na ọtụtụ metabolites. Nkezi nke nha atọ maka ụdị mmụba mkpụrụ osisi ọ bụla ± SE. Ahịrị isi awọ na-anọchite anya mmekọrịta 1:1. Mmekọrịta dị n'ime klas (ICC) nke nha ugboro ugboro egosiri na akara axis. NAD, nicotinamide adenine dinucleotide. (C) Ihe osise eserese nke usoro ọrụ nke nyocha metabolite onye ọrịa. A na-anakọta ascites ma ọ bụ etuto ahụ site na ndị ọrịa ma na-echekwa cryopreserved. E jiri cytometry flow nyochaa obere akụkụ nke ihe nlele ọ bụla, ebe ihe nlele ndị fọdụrụ gafere agba atọ nke mmụba mkpụrụ osisi CD4+, CD8+ na CD45. E jiri LC-MS/MS nyochaa akụkụ mkpụrụ ndụ ndị a. (D) Maapụ okpomọkụ nke mmụba mkpụrụ osisi ọkọlọtọ. Dendrogram na-anọchite anya nchịkọta Ward nke anya Euclidean n'etiti ihe nlele. (E) Nnyocha akụkụ bụ isi (PCA) nke maapụ metabolite ihe nlele, nke na-egosi ihe atụ atọ nke ihe nlele ọ bụla, ihe nlele sitere n'otu onye ọrịa ahụ jikọtara site na ahịrị. (F) PCA nke profaịlụ metabolite nke ihe nlele ahụ nke edobere n'ahụ onye ọrịa (ya bụ, site na iji akụkụ nke redundancy); ụdị ihe nlele ahụ nwere oke site na akụkụ convex. PC1, akụkụ bụ isi 1; PC2, akụkụ bụ isi 2.
Na-esote, anyị jiri usoro mmụba a nyochaa metabolites 99 dị na CD4 +, CD8 + na CD45-cell fractions na primary ascites na tumors nke ndị ọrịa HGSC isii (Foto 2C, Foto S3A na Tebụl S3 na S4). Ọnụọgụgụ ndị nwere mmasị na-eru 2% ruo 70% nke nnukwu ihe nlele mbụ nke mkpụrụ ndụ dị ndụ, oke nke mkpụrụ ndụ dịkwa iche iche n'etiti ndị ọrịa. Mgbe anyị kewasịrị beads ahụ, akụkụ bara ụba nke mmasị (CD4+, CD8+ ma ọ bụ CD45-) na-aza ihe karịrị 85% nke mkpụrụ ndụ dị ndụ niile dị na ihe nlele ahụ na nkezi. Usoro mmụba a na-enye anyị ohere inyocha ọnụọgụgụ mkpụrụ ndụ site na metabolism anụ ahụ tumor mmadụ, nke agaghị ekwe omume ime site na nnukwu ihe nlele. Site na iji usoro a, anyị kpebiri na l-kynurenine na adenosine, metabolites immunosuppressive abụọ a mara nke ọma dị elu na mkpụrụ ndụ tumor T ma ọ bụ mkpụrụ ndụ tumor (Foto S3, B na C). Ya mere, nsonaazụ ndị a na-egosi ikwesị ntụkwasị obi na ikike nkewa sel anyị na teknụzụ spectrometry mass iji chọta metabolites dị mkpa na bayoloji na anụ ahụ ndị ọrịa.
Nnyocha anyị gosikwara nkewa siri ike nke ụdị mkpụrụ ndụ n'ime na n'etiti ndị ọrịa (Foto 2D na Foto S4A). Karịsịa, ma e jiri ya tụnyere ndị ọrịa ndị ọzọ, ndị ọrịa 70 gosipụtara njirimara metabolic dị iche iche (Foto 2E na Foto S4B), na-egosi na enwere ike ịnwe nnukwu ọdịiche metabolic n'etiti ndị ọrịa. Ọ dị mkpa ịmara na ma e jiri ya tụnyere ndị ọrịa ndị ọzọ (lita 1.2 ruo 2; Tebụl S1), mkpokọta ascites anakọtara na ndị ọrịa 70 (80 ml) pere mpe. Njikwa nke ọdịiche dị n'etiti ndị ọrịa n'oge nyocha ihe mejupụtara isi (dịka ọmụmaatụ, site na iji nyocha redundancy akụkụ) na-egosi mgbanwe na-agbanwe agbanwe n'etiti ụdị mkpụrụ ndụ, a na-achịkọtakwa ụdị mkpụrụ ndụ na/ma ọ bụ gburugburu ebe obibi dịka profaịlụ metabolite si dị (Foto 2F). Nyocha nke metabolites otu mesiri ike mmetụta ndị a ma gosipụta nnukwu ọdịiche dị n'etiti ụdị mkpụrụ ndụ na gburugburu ebe obibi. Ọ dị mkpa ịmara na ọdịiche kachasị ukwuu a hụrụ bụ MNA, nke a na-ejikarị emeju na mkpụrụ ndụ CD45 na mkpụrụ ndụ CD4+ na CD8+ nke na-abanye n'ime etuto ahụ (Foto 3A). Maka mkpụrụ ndụ CD4+, mmetụta a pụtara ìhè nke ukwuu, MNA dị na mkpụrụ ndụ CD8+ yikwara ka gburugburu ebe obibi na-emetụta ya nke ukwuu. Agbanyeghị, nke a adịghị mkpa, n'ihi na naanị mmadụ atọ n'ime ndị ọrịa isii ka a pụrụ inyocha maka akara CD8+ tumor. Na mgbakwunye na MNA, n'ụdị mkpụrụ ndụ dị iche iche dị na ascites na tumor, metabolites ndị ọzọ na-adịghị mma na TIL nwekwara ọtụtụ ihe dị iche iche (Foto S3 na S4). Ya mere, data ndị a na-ekpughe otu metabolites immunomodulatory dị mma maka nyocha ọzọ.
(A) Ọdịnaya MNA a haziri nke ọma na mkpụrụ ndụ CD4+, CD8+ na CD45- site na ascites na tumor. Ihe osise igbe ahụ na-egosi etiti (ahịrị), oke interquartile (mgbanye etiti) na oke data, ruo ugboro 1.5 nke oke interquartile (whisker etiti). Dịka akọwara na Ihe Ndị Ọrịa na Ụzọ, jiri uru limma nke onye ọrịa chọpụta uru P (*P<0.05 na **P<0.01). (B) Ihe osise eserese nke metabolism MNA (60). Metabolites: S-adenosyl-1-methionine; SAH, S-adenosine-1-homocysteine; NA, nicotinamide; MNA, 1-methylnicotinamide; 2-PY, 1-methyl- 2-pyridone-5-carboxamide; 4-PY, 1-methyl-4-pyridone-5-carboxamide; NR, nicotinamide ribose; NMN, nicotinamide mononucleotide. Enzymes (akwụkwọ ndụ akwụkwọ ndụ): NNMT, nicotinamide N-methyltransferase; SIRT, sirtuins; NAMPT, nicotinamide phosphoribosyl transferase; AOX1, aldehyde oxidase 1; NRK, nicotinamide riboside kinase; NMNAT, nicotinamide mono Nucleotide adenylate transferase; Pnp1, purine nucleoside phosphorylase. (C) t-SNE nke scRNA-seq nke ascites (isi awọ) na etuto ahụ (ọbara ọbara; n = ndị ọrịa 3). (D) Ngosipụta NNMT na ọnụọgụ sel dị iche iche achọpụtara site na iji scRNA-seq. (E) Ngosipụta nke NNMT na AOX1 na SK-OV-3, akụrụ embryo mmadụ (HEK) 293T, mkpụrụ ndụ T na mkpụrụ ndụ T nke MNA gwọrọ. A na-egosi ngosipụta a kpọchiri akpọchi ma e jiri ya tụnyere SK-OV-3. A na-egosi ụkpụrụ ngosipụta na SEM (n = 6 ndị nyere onyinye ahụike). A na-ewere ụkpụrụ Ct karịrị 35 dị ka ihe a na-apụghị ịchọpụta (UD). (F) Ngosipụta nke SLC22A1 na SLC22A2 na mkpụrụ ndụ T nke ejiri 8mM MNA gwọọ. A na-egosi ngosipụta a kpọchiri akpọchi ma e jiri ya tụnyere SK-OV-3. A na-egosi ụkpụrụ ngosipụta nke SEM (n = 6 ndị na-enye onyinye ahụike). A na-ewere ụkpụrụ Ct karịrị 35 dị ka ihe a na-apụghị ịchọpụta (UD). (G) Ọdịnaya MNA nke mkpụrụ ndụ na mkpụrụ ndụ T nke onye na-enye onyinye ahụike mgbe awa 72 nke ịmịnye ya na MNA gasịrị. A na-egosi ụkpụrụ ngosipụta nke SEM (n = 4 ndị na-enye onyinye ahụike).
A na-emepụta MNA site na ibufe otu methyl site na S-adenosyl-1-methionine (SAM) gaa na nicotinamide (NA) site na nicotinamide N-methyltransferase (NNMT; Foto 3B). NNMT na-apụtakarị n'ọtụtụ ọrịa kansa mmadụ ma jikọtara ya na mmụba, mwakpo na metastasis (25-27). Iji ghọta nke ọma isi iyi nke MNA na mkpụrụ ndụ T na TME, anyị jiri scRNA-seq kọwaa ngosipụta nke NNMT n'ofe ụdị mkpụrụ ndụ na ascites na etuto nke ndị ọrịa HGSC atọ (Tebụl S5). Nyocha nke ihe dị ka mkpụrụ ndụ 6,500 gosiri na na gburugburu ascites na tumor, ngosipụta NNMT bụ naanị na ọnụọgụ fibroblast na mkpụrụ ndụ tumor a na-eche na ha (Foto 3, C na D). Ọ dị mkpa ịmara na enweghị ngosipụta NNMT doro anya na ọnụọgụ ọ bụla nke na-egosipụta PTPRC (CD45 +) (Foto 3D na Foto S5A), nke na-egosi na ewebatala MNA achọpụtara na metabolite spectrum n'ime mkpụrụ ndụ T. Ngosipụta nke aldehyde oxidase 1 (AOX1) na-agbanwe MNA ka ọ bụrụ 1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide (2-PYR) ma ọ bụ 1-methyl-4-pyridone-5-carboxamide (4-PYR); Foto 3B) dịkwa naanị na ọnụọgụgụ fibroblasts na-egosipụta COL1A1 (Foto S5A), nke na-egosi na mkpụrụ ndụ T enweghị ike nke metabolism MNA nkịtị. Ejiri data sel nke abụọ nọọrọ onwe ya sitere na ascites sitere na ndị ọrịa HGSC kwado ụkpụrụ ngosipụta nke mkpụrụ ndụ ihe nketa ndị a metụtara MNA (Foto S5B; n = 6) (16). Na mgbakwunye, nyocha nke quantitative polymerase chain reaction (qPCR) nke mkpụrụ ndụ T onye nyere aka ahụike ejiri MNA gwọọ gosiri na ma e jiri ya tụnyere mkpụrụ ndụ kansa ovarian SK-OV-3 na-achịkwa, NNMT ma ọ bụ AOX1 fọrọ nke nta ka ọ ghara ịpụta ìhè (Foto 3E). Nsonaazụ ndị a a na-atụghị anya ya na-egosi na enwere ike ịpụta MNA site na fibroblasts ma ọ bụ etuto ahụ n'ime mkpụrụ ndụ T dị nso na TME.
Ọ bụ ezie na ndị a ga-etinye aka gụnyere ezinụlọ nke ndị na-ebufe cation organic 1 ruo 3 (OCT1, OCT2 na OCT3) nke ezinụlọ onye na-ebufe 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 na SLC22A3 dere, ndị nwere ike ibufe MNA ka bụ ndị a na-akọwaghị (28). QPCR nke mRNA sitere na mkpụrụ ndụ T onye na-enye onyinye dị mma gosiri ọkwa ngosipụta dị ala nke SLC22A1 mana a naghị achọpụta ọkwa SLC22A2, nke kwadoro na akọpụtala ya na mbụ n'akwụkwọ (Foto 3F) (29). N'ụzọ dị iche, ahịrị mkpụrụ ndụ kansa nke SK-OV-3 gosipụtara ọkwa dị elu nke ndị na-ebufe abụọ ahụ (Foto 3F).
Iji nwalee ohere nke mkpụrụ ndụ T nwere ike ịmịkọrọ MNA mba ọzọ, a kụnyere mkpụrụ ndụ T ndị na-enye onyinye ahụ ike ruo awa 72 n'ihu ọnụnọ nke MNA dị iche iche. N'enweghị MNA mpụga, enweghị ike ịchọpụta ọdịnaya mkpụrụ ndụ nke MNA (Foto 3G). Agbanyeghị, mkpụrụ ndụ T ndị a na-arụ ọrụ nke ejiri MNA mpụga gwọọ gosiri mmụba dabere na dose na ọdịnaya MNA na mkpụrụ ndụ, ruo 6 mM MNA (Foto 3G). Nsonaazụ a na-egosi na n'agbanyeghị obere ọkwa nke ngosipụta onye na-ebuga na enweghị enzyme bụ isi nke na-ahụ maka metabolism MNA n'ime sel, TIL ka nwere ike iburu MNA.
Ụdị metabolites dị na mkpụrụ ndụ T nke ndị ọrịa na nnwale nnabata MNA na vitro na-eme ka o kwe omume na fibroblasts metụtara kansa (CAF) na-ewepụta MNA, mkpụrụ ndụ tumor nwekwara ike ịchịkwa ụdị na ọrụ nke TIL. Iji chọpụta mmetụta nke MNA na mkpụrụ ndụ T, a na-arụ ọrụ mkpụrụ ndụ T nke na-enye onyinye dị mma na vitro ma ọ bụrụ na MNA adịghị ma ọ bụ na ha enweghị, a na-enyocha mmụba ha na mmepụta cytokine ha. Mgbe ụbọchị 7 nke itinye MNA na oke kachasị elu gasịrị, ọnụọgụgụ ọnụọgụgụ mmadụ belatara nke ọma, ebe a nọgidere na-enwe ike na doses niile (Foto 4A). Na mgbakwunye, ọgwụgwọ nke MNA mpụga mere ka mmụba na oke nke mkpụrụ ndụ CD4 + na CD8 + T na-egosipụta tumor necrosis factor-α (TNFα; Foto 4B). N'ụzọ dị iche, mmepụta IFN-γ dị obere na mkpụrụ ndụ CD4 + T, mana ọ bụghị na mkpụrụ ndụ CD8 + T, ọ nweghịkwa mgbanwe dị ukwuu na interleukin 2 (IL-2; Foto 4, C na D). Ya mere, nnwale immunosorbent nke enzyme-linked immunosorbent (ELISA) nke supernatants sitere na ọdịbendị mkpụrụ ndụ T ndị a nke MNA gwọrọ gosiri mmụba dị ukwuu na TNFα, mbelata na IFN-γ, na enweghị mgbanwe na IL-2 (Foto 4, E ruo G). . Mbelata nke IFN-γ na-egosi na MNA nwere ike ịrụ ọrụ n'igbochi ọrụ mgbochi-tumor nke mkpụrụ ndụ T. Iji mee ka mmetụta nke MNA na cytotoxicity nke mkpụrụ ndụ T na-akpata, mkpụrụ ndụ chimeric antigen receptor T (FRα-CAR-T) nke na-elekwasị anya na folate receptor α na CAR-T (GFP) nke protein fluorescent green (GFP) -CAR-T na-achịkwa bụ mkpụrụ ndụ site na mkpụrụ ndụ mononuclear ọbara dị mma (PBMC). E mepụtara mkpụrụ ndụ CAR-T ruo awa 24 n'ihu MNA, wee jikọta ya na mkpụrụ ndụ kansa ovarian SK-OV-3 nke na-egosipụta folate receptor α na oke ihe mgbaru ọsọ nke 10:1. Ọgwụgwọ MNA butere mbelata dị ukwuu na ọrụ igbu mkpụrụ ndụ FRα-CAR-T, nke yiri mkpụrụ ndụ FRα-CAR-T ejiri adenosine gwọọ (Foto 4H).
(A) Ngụkọta ọnụọgụgụ mkpụrụ ndụ dị ndụ na ọnụọgụgụ mmadụ na-amụba (PD) ozugbo site na omenala n'ụbọchị nke 7. Graatị mmanya ahụ na-anọchite anya nkezi + SEM nke ndị na-enye onyinye isii dị mma. Na-anọchite anya data sitere na opekata mpe n = nnwale 3 nọọrọ onwe ha. (B ruo D) ejiri CD3/CD28 na IL-2 mee ka mkpụrụ ndụ T rụọ ọrụ na mkpokọta MNA ha ruo ụbọchị 7. Tupu nyocha ahụ, ejiri PMA/ionomycin na GolgiStop kpalie mkpụrụ ndụ ruo awa 4. Ngosipụta TNFα (B) na mkpụrụ ndụ T. Foto ihe atụ (aka ekpe) na data tabular (n'aka nri) nke ngosipụta TNFα na mkpụrụ ndụ dị ndụ. Ngosipụta IFN-γ (C) na IL-2 (D) na mkpụrụ ndụ T. A tụrụ ngosipụta nke cytometry site na cytometry flow. Graatị mmanya ahụ na-anọchite anya nkezi (n = 6 ndị na-enye onyinye ahụike) + SEM. Jiri otu ụzọ nyocha nke mgbanwe na nha ugboro ugboro (*P<0.05 na **P<0.01) iji chọpụta uru P. Na-anọchite anya data sitere na opekata mpe n = nnwale 3 nọọrọ onwe ha. (E ruo G) ejiri CD3/CD28 na IL-2 mee ka mkpụrụ ndụ T rụọ ọrụ na mkpokọta MNA ha ruo ụbọchị 7. A nakọtara ihe dị n'ime ya tupu na mgbe awa 4 nke mkpali PMA/ionomycin gasịrị. E jiri ELISA tụọ mkpokọta TNFα (E), IFN-γ (F) na IL-2 (G). Graafụ mmanya ahụ na-anọchite anya nkezi (n = 5 ndị ​​na-enye ahụ ike) + SEM. Ejiri otu ụzọ nyocha nke mgbanwe na nha ugboro ugboro chọpụta uru P. Ahịrị ntụpọ ahụ na-egosi oke nchọpụta nke nchọpụta ahụ. (H) Nnyocha lysis sel. Ejiri adenosine (250μM) ma ọ bụ MNA (10 mM) gbanwee mkpụrụ ndụ FRα-CAR-T ma ọ bụ GFP-CAR-T ruo awa 24, ma ọ bụ hapụ ya ka ọ ghara ịgwọ ya (Ctrl). A tụrụ pasentị ogbugbu nke mkpụrụ ndụ SK-OV-3. Uru P dabere na ule Welch t (*P<0.5 na **P<0.01).
Iji nweta nghọta usoro nke iwu ngosipụta TNFα dabere na MNA, a tụlere mgbanwe ndị dị na TNFα mRNA nke mkpụrụ ndụ T ejiri MNA gwọọ (Foto 5A). Mkpụrụ ndụ T onye na-enye onyinye ahụike ejiri MNA gwọọ gosiri mmụba okpukpu abụọ na ọkwa ntụgharị TNFα, na-egosi na MNA dabere na iwu ntụgharị TNFα. Iji nyochaa usoro iwu a nwere ike ime, a tụlere ihe abụọ a maara nke na-achịkwa TNFα, ya bụ ihe na-eme ka T cell nuclear factor rụọ ọrụ (NFAT) na protein 1 (Sp1) kpọmkwem, na nzaghachi maka njikọ MNA na onye na-akwalite TNFα dị nso (30). Onye na-akwalite TNFα nwere ebe njikọta NFAT isii achọpụtara na ebe njikọta Sp1 abụọ, na-ejikọta na otu ebe [-55 isi pairs (bp) site na 5'cap] (30). Chromatin immunoprecipitation (ChIP) gosiri na mgbe ejiri MNA gwọọ ya, njikọ nke Sp1 na onye na-akwalite TNFα mụbara ugboro atọ. Ntinye nke NFAT mụbara ma rute mkpa (Foto 5B). Data ndị a na-egosi na MNA na-achịkwa ngosipụta nke TNFα site na ntụgharị Sp1, na obere akụkụ ngosipụta nke NFAT.
(A) Ma e jiri ya tụnyere mkpụrụ ndụ T e mepụtara na-enweghị MNA, mgbanwe mpịachi nke ngosipụta TNFα na mkpụrụ ndụ T e ji MNA gwọọ. A na-egosi ụkpụrụ ngosipụta ya na SEM (n = 5 ndị ​​na-enye ahụ ike). Na-anọchite anya data sitere na opekata mpe n = nnwale 3 nọọrọ onwe ha. (B) Onye na-akwalite TNFα nke mkpụrụ ndụ T e jiri ma ọ bụ na-enweghị 8 mM MNA mgbe NFAT na Sp1 jikọtara ya na mkpali (Ctrl) na PMA/ionomycin ruo awa 4. Ejiri Immunoglobulin G (IgG) na H3 mee ihe dị ka njikwa na-adịghị mma na nke dị mma maka immunoprecipitation, n'otu n'otu. Nha nke ChIP gosiri na njikọ nke Sp1 na NFAT na onye na-akwalite TNFα na mkpụrụ ndụ e ji MNA gwọọ mụbara ugboro ugboro ma e jiri ya tụnyere njikwa ahụ. Na-anọchite anya data sitere na opekata mpe n = nnwale 3 nọọrọ onwe ha. Uru P nke a chọpụtara site na ọtụtụ ule t (*** P <0.01). (C) Ma e jiri ya tụnyere ascites nke HGSC, mkpụrụ ndụ T (na-abụghị cytotoxic) gosipụtara mmụba nke ngosipụta TNF na etuto ahụ. Agba ndị ahụ na-anọchite anya ndị ọrịa dị iche iche. A na-enyocha mkpụrụ ndụ ndị a na-egosi na 300 ma na-emegharị ha iji belata oke ịdọrọ (** Padj = 0.0076). (D) Ụdị MNA akwadoro maka ọrịa kansa ovarian. A na-emepụta MNA na mkpụrụ ndụ tumor na fibroblasts na TME ma mkpụrụ ndụ T na-ewere ya. MNA na-eme ka njikọ nke Sp1 na onye na-akwalite TNFα dịkwuo elu, na-eduga na mmụba nke ntụgharị TNFα na mmepụta cytokine TNFα. MNA na-emekwa ka IFN-γ belata. Mgbochi nke ọrụ mkpụrụ ndụ T na-eduga na mbelata ikike igbu mmadụ na mmụba nke etuto ahụ ngwa ngwa.
Dịka akụkọ si kwuo, TNFα nwere mmetụta mgbochi ọrịa kansa na mgbochi ọrịa kansa n'ihu na azụ, mana ọ nwere ọrụ a ma ama n'ịkwalite uto na metastasis nke kansa ovarian (31-33). Dịka akụkọ si kwuo, ntinye nke TNFα na ascites na anụ ahụ tumor na ndị ọrịa nwere kansa ovarian dị elu karịa nke dị na anụ ahụ na-adịghị mma (34-36). N'ihe gbasara usoro, TNFα nwere ike ịchịkwa mkpali, ọrụ na mmụba nke mkpụrụ ndụ ọbara ọcha, ma gbanwee ụdị mkpụrụ ndụ kansa (37, 38). Dịka nchọpụta ndị a si dị, nyocha ngosipụta mkpụrụ ndụ ihe nketa dị iche iche gosiri na TNF amụbaala nke ukwuu na mkpụrụ ndụ T na anụ ahụ tumor ma e jiri ya tụnyere ascites (Foto 5C). Mmụba na ngosipụta TNF pụtara ìhè naanị na mkpụrụ ndụ T nwere ụdị ọrịa kansa na-abụghị cytotoxic (Foto S5A). Na nchịkọta, data ndị a na-akwado echiche na MNA nwere mmetụta mgbochi ọrịa abụọ na mmepe tumor na HGSC.
Akara ngosi fluorescent dabere na cytometry flow aghọwo ụzọ bụ isi maka ịmụ banyere metabolism TIL. Ọmụmụ ihe ndị a egosila na ma e jiri ya tụnyere lymphocytes ọbara dị n'akụkụ ma ọ bụ mkpụrụ ndụ T sitere na akụkụ lymphoid nke abụọ, murine na TIL mmadụ nwere oke ọchịchọ ịnabata glucose (4, 39) na mfu nwayọ nke ọrụ mitochondrial (19, 40). Ọ bụ ezie na anyị ahụla nsonaazụ ndị yiri ya na ọmụmụ ihe a, mmepe dị mkpa bụ iji tụnyere metabolism nke mkpụrụ ndụ tumor na TIL site na otu anụ ahụ tumor a chụpụrụ. Dịka ụfọdụ akụkọ ndị a gara aga si dị, mkpụrụ ndụ tumor (CD45-EpCAM +) sitere na ascites na tumor nwere oke nnabata glucose karịa mkpụrụ ndụ CD8 + na CD4 + T, na-akwado na enwere ike iji oke nnabata glucose nke mkpụrụ ndụ tumor tụnyere mkpụrụ ndụ T. Echiche nke asọmpi mkpụrụ ndụ T. TME. Agbanyeghị, ọrụ mitochondrial nke mkpụrụ ndụ tumor dị elu karịa nke mkpụrụ ndụ CD8 + T, mana ọrụ mitochondrial yiri nke mkpụrụ ndụ CD4 + T. Nsonaazụ ndị a na-eme ka isiokwu na-apụta ìhè na metabolism oxidative dị mkpa maka mkpụrụ ndụ tumor (41, 42). Ha na-atụkwa aro na mkpụrụ ndụ CD8 + T nwere ike ịdị mfe ịnweta nsogbu oxidative karịa mkpụrụ ndụ CD4 + T, ma ọ bụ na mkpụrụ ndụ CD4 + T nwere ike iji isi iyi carbon na-abụghị glucose iji nọgide na-arụ ọrụ mitochondrial (43, 44). Ọ dị mkpa ịmara na anyị ahụghị ihe dị iche na nnabata glucose ma ọ bụ ọrụ mitochondrial n'etiti ndị na-eme ihe CD4 + T, ebe nchekwa T na mkpụrụ ndụ ebe nchekwa T dị na ascites. N'otu aka ahụ, ọnọdụ ọdịiche nke mkpụrụ ndụ CD8 + T na etuto ahụ enweghị ihe jikọrọ ya na mgbanwe na nnabata glucose, na-egosipụta ọdịiche dị mkpa n'etiti mkpụrụ ndụ T a zụlitere na vitro na TIL mmadụ na vivo (22). E gosikwara ihe ndị a site na iji nkesa ọnụọgụgụ mkpụrụ ndụ akpaka na-enweghị mmasị, nke kpughekwara na mkpụrụ ndụ CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + nwere oke nnabata glucose na ọrụ mitochondrial karịa mkpụrụ ndụ tumor bụ ihe a na-ahụkarị mana ha nwere ọnụọgụgụ mkpụrụ ndụ na-arụ ọrụ Metabolic. Ndị a nwere ike ịnọchite anya obere ọnụọgụgụ mkpụrụ ndụ myeloid na-egbochi myeloid ma ọ bụ mkpụrụ ndụ dendritic plasmacytoid achọpụtara na nyocha scRNA-seq. Ọ bụ ezie na akọpụtala ihe abụọ a n'ime etuto ahụ mmadụ [45], ha ka chọrọ ọrụ ọzọ bụ ịkọwa ọnụọgụgụ myeloid a.
Ọ bụ ezie na usoro ndị dabere na usoro cytometry nwere ike ịkọwa ọdịiche dị n'etiti glucose na metabolism oxidative n'etiti ụdị sel, a chọpụtabeghị metabolites ziri ezi nke glucose ma ọ bụ isi iyi carbon ndị ọzọ mepụtara maka metabolism mitochondrial na TME. Inye ọnụnọ ma ọ bụ enweghị metabolites na obere TIL enyere chọrọ nhicha nke ọnụọgụ sel site na anụ ahụ ewepụrụ. Ya mere, usoro mmụba sel anyị yana mass spectrometry nwere ike inye nghọta na metabolites ndị bara ụba na mkpụrụ ndụ T na ọnụọgụ sel tumor na ihe nlele ndị ọrịa kwekọrọ. Ọ bụ ezie na usoro a nwere uru karịa nhazi sel fluorescence-activated, ụfọdụ ọba akwụkwọ metabolite nwere ike imetụta n'ihi nkwụsi ike dị n'ime ya na/ma ọ bụ ọnụego ntụgharị ngwa ngwa (22). Agbanyeghị, usoro anyị nwere ike ịchọpụta metabolites immunosuppressive abụọ a ma ama, adenosine na kynurenine, n'ihi na ha dị iche iche n'etiti ụdị ihe nlele.
Nnyocha metabonomic anyị nke etuto ahụ na ụdị TIL na-enye nghọta ka ukwuu banyere ọrụ nke metabolites na TME nke ovarian. Nke mbụ, site na iji cytometry flow, anyị chọpụtara na ọ dịghị ihe dị iche na ọrụ mitochondrial n'etiti etuto ahụ na mkpụrụ ndụ CD4 + T. Agbanyeghị, nyocha LC-MS/MS kpughere nnukwu mgbanwe na ọtụtụ metabolites n'etiti ndị a, na-egosi na nkwubi okwu gbasara metabolism TIL na ọrụ metabolic ya dum chọrọ nkọwa nke ọma. Nke abụọ, MNA bụ metabolite nwere nnukwu ọdịiche dị n'etiti mkpụrụ ndụ CD45 na mkpụrụ ndụ T na ascites, ọ bụghị etuto ahụ. Ya mere, nhazi na ọnọdụ tumor nwere ike inwe mmetụta dị iche iche na metabolism TIL, nke na-egosipụta ọdịiche dị na gburugburu ebe obibi enyere. Nke atọ, ngosipụta nke enzyme na-emepụta MNA NNMT bụ naanị CAF, nke bụ mkpụrụ ndụ tumor ruo n'ókè dị nta, mana a na-ahụ ọkwa MNA a na-achọpụta na mkpụrụ ndụ T sitere na tumor. Ngosipụta oke nke NNMT na CAF nke ovarian nwere mmetụta na-akwalite kansa a maara, nke bụ n'ihi nkwalite nke metabolism CAF, mwakpo tumor na metastasis (27). Ọ bụ ezie na ọkwa TIL zuru oke dị obere, ngosipụta nke NNMT na CAF nwere njikọ chiri anya na ụdị mesenchymal nke Cancer Genome Atlas (TCGA), nke jikọtara ya na amụma na-adịghị mma (27, 46, 47). N'ikpeazụ, ngosipụta nke enzyme AOX1 nke na-akpata mbibi MNA dịkwa naanị na ndị CAF, nke na-egosi na mkpụrụ ndụ T enweghị ike ime ka MNA gbakee. Nsonaazụ ndị a na-akwado echiche ahụ na ọ bụ ezie na achọrọ ọrụ ọzọ iji kwado nchọpụta a, ọkwa dị elu nke MNA na mkpụrụ ndụ T nwere ike igosi ọnụnọ nke obere gburugburu ebe obibi CAF nke na-egbochi ahụ ike.
Ebe ọ bụ na e nwere obere ọkwa ngosipụta nke ndị na-ebuga MNA na ọkwa protein ndị a na-apụghị ịchọpụta nke ọma na metabolism MNA, ọnụnọ nke MNA na mkpụrụ ndụ T abụghị ihe a na-atụghị anya ya. A pụghị ịchọpụta NNMT ma ọ bụ AOX1 site na nyocha scRNA-seq na qPCR nke ndị otu abụọ nọọrọ onwe ha. Nsonaazụ ndị a na-egosi na mkpụrụ ndụ T anaghị emepụta MNA, kama ọ na-amịkọrọ ya site na TME gbara ya gburugburu. Nnwale in vitro na-egosi na mkpụrụ ndụ T na-agbakọta MNA mpụga.
Ọmụmụ ihe anyị na vitro egosila na MNA mpụga na-akpali ngosipụta nke TNFα na mkpụrụ ndụ T ma na-eme ka njikọ nke Sp1 na onye na-akwalite TNFα dịkwuo mma. Ọ bụ ezie na TNFα nwere ma ọrụ mgbochi-ọrịa na mgbochi-ọrịa, na kansa ovarian, TNFα nwere ike ịkwalite uto nke kansa ovarian (31-33). Nkwụsị nke TNFα na ọdịbendị mkpụrụ ndụ tumor ovarian ma ọ bụ iwepụ akara TNFα na ụdị òké nwere ike imeziwanye mmepụta cytokine mkpali nke TNFα ma gbochie uto tumor (32, 35). Ya mere, n'ọnọdụ a, MNA sitere na TME nwere ike ịrụ ọrụ dị ka metabolite pro-inflammatory site na usoro dabere na TNFα site na autocrine loop, si otú a na-akwalite mmepe na mgbasa nke kansa ovarian (31). Dabere na ohere a, a na-amụ mgbochi TNFα dị ka ihe nwere ike ịgwọ ọrịa kansa ovarian (37, 48, 49). Na mgbakwunye, MNA na-emebi cytotoxicity nke mkpụrụ ndụ CAR-T na mkpụrụ ndụ tumor ovarian, na-enye ihe akaebe ọzọ maka mgbochi mgbochi nke MNA na-akwalite. N'ozuzu, nsonaazụ ndị a na-egosi ụdị etuto ahụ na mkpụrụ ndụ CAF na-ewepụta MNA n'ime TME dị n'ime sel. Site na (i) mkpali uto nke kansa ovarian nke TNF kpatara na (ii) mgbochi ọrụ cytotoxic nke mkpụrụ ndụ T nke MNA kpatara, nke a nwere ike inwe mmetụta abụọ nke etuto ahụ (Foto 5D).
Na mmechi, site n'itinye njikọta nke mmụba sel ngwa ngwa, usoro otu sel na profaịlụ metabolic, ọmụmụ ihe a kpughere nnukwu ọdịiche immunometabolomic dị n'etiti etuto ahụ na sel ascites na ndị ọrịa HGSC. Nyocha zuru oke a gosiri na enwere ọdịiche dị na nnabata glucose na ọrụ mitochondrial n'etiti mkpụrụ ndụ T, ma chọpụta MNA dị ka metabolite na-achịkwa mgbochi onwe onye na-abụghị mkpụrụ ndụ. Data ndị a nwere mmetụta na otu TME si emetụta metabolism sel T na kansa mmadụ. Ọ bụ ezie na akọpụtala asọmpi kpọmkwem maka nri dị n'etiti mkpụrụ ndụ T na mkpụrụ ndụ kansa, metabolites nwekwara ike ịrụ ọrụ dị ka ndị na-achịkwa na-apụtaghị ìhè iji kwalite ọganihu tumor ma nwee ike igbochi nzaghachi mgbochi endogenous. Nkọwa ọzọ nke ọrụ ọrụ nke metabolites nchịkwa ndị a nwere ike imepe atụmatụ ndị ọzọ maka ime ka nzaghachi mgbochi ọrịa tumor dịkwuo mma.
E nwetara ihe nlele ndị ọrịa na data ahụike site na ebe nchekwa anụ ahụ kansa BC nke Canadian Tissue Repository Network kwadoro. Dịka usoro nke BC Cancer Research Ethics Committee na Mahadum British Columbia kwadoro (H07-00463), ihe nlele ndị ọrịa niile na data ahụike natara nkwenye ederede ma ọ bụ kagbuo nkwenye ha n'ụzọ iwu kwadoro. A na-echekwa ihe nlele ndị ahụ na BioBank asambodo (BRC-00290). E gosipụtara njirimara ndị ọrịa zuru ezu na Tebụl S1 na S5. Maka cryopreservation, a na-eji ihe mkpuchi isi iji gbazee ihe nlele kansa onye ọrịa n'ụzọ igwe wee pịa ya site na nzacha 100-micron iji nweta otu nkwusioru sel. E tinyere centrifuge nke onye ọrịa na 1500 rpm maka nkeji iri na 4°C iji mee ka mkpụrụ ndụ ahụ dị nro ma wepụ ihe fọdụrụ. E debere mkpụrụ ndụ ndị e nwetara site na etuto ahụ na ascites n'ime 50% serum mmadụ AB nke na-anaghị arụ ọrụ nke ọma (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) na 10% dimethyl sulfoxide. E gbazee ihe ndị a e chekwara otu mkpụrụ ndụ ma jiri ha mee ihe maka metabolomics na nchọpụta metabolite nke akọwara n'okpuru.
Ngwa zuru oke nwere 0.22 μm nzacha RPMI 1640 50:50 agbakwunyere: AimV. RPMI 1640 + 2.05 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) nke ejiri 10% serum AB nke na-anaghị ekpo ọkụ (Sigma-Aldrich), 12.5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) Fisher Scientific), 1 x Penicillin Streptomycin (PenStrep) solution (Thermo Fisher Scientific) na 50 μMB-mercaptoethanol. A na-agbakwunye AimV (Invitrogen) na 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) na 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific). Ihe nchekwa cytometer nke na-agba ọsọ nwere 0.22μm phosphate buffered saline (PBS; Invitrogen) nke ejiri 3% serum AB nke na-anaghị ekpo ọkụ (Sigma) tinye. Ihe nchekwa nchekwa mkpụrụ ndụ bụ PBS a mịrị amị nke 0.22μm ma tinye ya na serum AB mmadụ nke na-anaghị ekpo ọkụ (Sigma-Aldrich).
N'ime ọkara zuru oke nke 37°C, e ji 10 nM MT DR na 100 μM 2-NBDG tee mkpụrụ ndụ ahụ ihe ruru nkeji iri atọ. Mgbe nke ahụ gasịrị, e ji agba ndụ eF506 tee mkpụrụ ndụ ahụ ihe ruru nkeji iri na ise. Tinyeghachi mkpụrụ ndụ ndị ahụ na FC Block (eBioscience) na Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), gwakọta ha na ihe nchekwa mmiri cytometer (dịka ntuziaka onye nrụpụta si dị), ma tinye ha na okpomọkụ ụlọ maka nkeji iri. Jiri ihe mgbochi nje mee ka mkpụrụ ndụ ahụ dị ọcha (Tebụl S2) na ihe nchekwa mmiri cytometry na 4°C maka nkeji iri abụọ. Tinyeghachi mkpụrụ ndụ ndị ahụ na ihe nchekwa mmiri cytometry na 4°C tupu nyocha. Jiri SpectroFlo na FlowJo V10 nyochaa data ọnụọgụ mkpụrụ ndụ, ma jiri GraphPad Prism 8 mepụta data ahụ. E mere ka ike ọkụ eletrik etiti (MFI) nke 2-NBDG na MT DR dị mma, e mesịa jiri ule t abụọ mee ihe maka nyocha ọnụọgụgụ iji kọwaa ndị ọrịa dakọtara. Wepụ ọnụọgụgụ mmadụ niile nwere ihe na-erughị ihe omume 40 na nyocha ahụ; tinye uru MFI nke 1 maka uru ọ bụla na-adịghị mma tupu ịme nyocha ọnụọgụgụ na onyonyo data.
Iji mee ka usoro nhazi aka nke panel usoro dị n'elu dịkwuo mma, anyị jiri nkọwa zuru oke nke osisi mmachi ọdịdị (FAUST) (21) nye mkpụrụ ndụ na akpaghị aka mgbe ewepụsịrị mkpụrụ ndụ nwụrụ anwụ na FlowJo. Anyị ji aka anyị jikwaa mmepụta iji jikọta ọnụọgụ ndị yiri ka a na-ekeghị ha nke ọma (ijikọta PD1+ na mkpụrụ ndụ PD1-tumor) na ọnụọgụ ndị a na-ejide. Ihe nlele ọ bụla nwere nkezi nke ihe karịrị 2% mkpụrụ ndụ, maka ngụkọta nke ọnụọgụ 11.
E jiri centrifugation nke Ficoll gradient gradient kewapụ PBMC na ngwaahịa nkewa leukocyte (STEMCELL Technologies). E jiri CD8 MicroBeads (Miltenyi) kewapụ mkpụrụ ndụ CD8 + T na PBMC ma gbasaa ha na ọkara zuru oke site na iji TransAct (Miltenyi) ruo izu abụọ dịka ntuziaka onye nrụpụta si dị. E kwere ka mkpụrụ ndụ ndị ahụ nọrọ ruo ụbọchị ise na ọkara zuru oke nwere IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), wee kpalite ha ọzọ na TransAct. N'ụbọchị nke asaa, dịka ntuziaka onye nrụpụta si dị, e jiri CD45 MicroBeads mmadụ (Miltenyi) mee ka mkpụrụ ndụ baa ọgaranya na agba atọ n'usoro. E kewara mkpụrụ ndụ ndị ahụ maka nyocha cytometry flow (dịka akọwara n'elu), e kewakwara otu nde mkpụrụ ndụ ugboro atọ maka nyocha LC-MS/MS. E jiri LC-MS/MS hazie ihe nlele ndị ahụ dịka akọwara n'okpuru. Anyị mere atụmatụ uru metabolite na-efu na ọnụọgụ ion nke 1,000. A na-eme ka ihe nlele ọ bụla dị ka ọnụọgụ ion zuru oke (TIC), gbanwee ya na logarithm ma mee ka ọ dị ka nke ọma na MetaboAnalystR tupu nyocha.
A gbazere otu nkwụsịtụ mkpụrụ ndụ nke onye ọrịa ọ bụla site na nzacha 40 μm ka ọ bụrụ ihe zuru oke (dịka akọwara n'elu). Dịka usoro onye nrụpụta si dị, ejiri MicroBeads (Miltenyi) mee ihe ugboro atọ n'usoro nke nhọrọ dị mma site na nkewa magnetik beads iji mee ka ihe nlele maka mkpụrụ ndụ CD8+, CD4+ na CD45- bawanye (n'elu ice). Na nkenke, a na-etinye mkpụrụ ndụ ndị ahụ ọzọ na nchekwa mkpụrụ ndụ (dịka akọwara n'elu) ma gụọ ha. A na-etinye mkpụrụ ndụ ndị ahụ na mkpuchi CD8 mmadụ, mkpuchi CD4 mmadụ ma ọ bụ mkpuchi CD45 mmadụ (Miltenyi) na okpomọkụ 4°C maka nkeji 15, wee jiri ihe nchekwa mkpụrụ ndụ saa ha. A na-agafe ihe nlele ahụ site na kọlụm LS (Miltenyi), a na-anakọtakwa akụkụ dị mma na nke na-adịghị mma. Iji belata oge ma mee ka usoro mgbake mkpụrụ ndụ dịkwuo elu, a na-eji akụkụ CD8 maka agba nke abụọ nke nkwalite CD4+, a na-ejikwa akụkụ CD44 maka nkwalite CD45 na-esote. Debe ngwọta ahụ na ice n'oge usoro nkewa ahụ.
Iji kwadebe ihe nlele maka nyocha metabolite, a sachara mkpụrụ ndụ ahụ otu ugboro na mmiri nnu oyi-ice, a gbakwụnyekwara 1 ml nke methanol 80% na ihe nlele ọ bụla, wee gbanye ya ma kpọnwụọ ya na nitrogen mmiri mmiri. E tinyere ihe nlele ndị ahụ ugboro atọ n'ime usoro ịgbaze-mmiri ma gbanye ya na 14,000 rpm maka nkeji iri na ise na 4°C. A na-ekupụ ihe fọdụrụ nke nwere metabolites ahụ ruo mgbe ọ kpọrọ nkụ. A gbazee metabolites ndị ahụ ọzọ na 50 μl nke 0.03% formic acid, gbanye ya ka ọ gwakọta ya, wee tinye ya na centrifuge iji wepụ ihe ndị mebiri emebi.
Wepụta metabolites dịka akọwara n'elu. Bufee ihe mkpuchi ahụ na karama chromatography mmiri mmiri dị elu maka nyocha metabolomics. Jiri usoro ọgwụgwọ na-enweghị usoro iji gwọọ ihe nlele ọ bụla na ọnụọgụ sel yiri ya iji gbochie mmetụta ogbe. Anyị mere nyocha nke ọma nke metabolites zuru ụwa ọnụ ebipụtara na AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50). Ejiri ngwanrọ MultiQuant version 2.1 (Applied Biosystems SCIEX) mee nyocha Chromatographic na njikọta mpaghara peak.
E jiri ọnụọgụ ion nke 1000 mee atụmatụ uru metabolite na-efu, e jikwa TIC nke ihe nlele ọ bụla gbakọọ mpaghara elu nke metabolite ọ bụla achọpụtara iji dozie mgbanwe ndị nyocha ngwaọrụ webatara site na nhazi ihe nlele. Mgbe emechara TIC ka ọ dị mma, a na-eji MetaboAnalystR(51) (paramita ndabara) maka mgbanwe logarithmic na nhazi ahịrị nkịtị akpaka. Anyị jiri PCA na ngwugwu vegan R mee nyocha nchọpụta nke ọdịiche metabolome n'etiti ụdị ihe nlele, ma jiri nyocha redundancy akụkụ iji nyochaa ndị ọrịa. Jiri usoro Ward wuo dendrogram map okpomọkụ iji chịkọta anya Euclidean n'etiti ihe nlele. Anyị jiri limma (52) na oke metabolite ọkọlọtọ iji chọpụta metabolites dị iche iche n'ofe ụdị sel na gburugburu micro. Iji mee ka nkọwa ahụ dị mfe, anyị na-eji paramita nkezi otu iji kọwaa ihe nlereanya ahụ, ma tụlee ụdị sel dị na gburugburu micro dị ka otu ọ bụla (n = otu 6); Maka ule dị mkpa, anyị mere nha ugboro atọ maka metabolite ọ bụla Iji zere mmeghari ụgha, etinyere onye ọrịa ahụ dị ka ihe mgbochi na nhazi limma. Iji lelee ọdịiche dị na metabolites dị n'etiti ndị ọrịa dị iche iche, anyị gbanwere ụdị limma gụnyere ndị ọrịa n'ụzọ a kapịrị ọnụ. Anyị na-akọ akụkọ mkpa nke ọdịiche akọwapụtara n'etiti ụdị sel na gburugburu ebe obibi Padj <0.05 (mmezi Benjamin-Hochberg).
Mgbe ejiri ngwa mwepụ mkpụrụ ndụ nwụrụ anwụ nke Miltenyi (ihe karịrị pasent 80 nke ike ndụ) mee ka usoro transcriptome nke otu mkpụrụ ndụ dị ndụ na mkpokọta ascites dị ndụ na ihe atụ tumor site na iji usoro ngosipụta nke mkpụrụ ndụ 10x 5′. E nyochachara ikpe ise nwere etuto na ascites kwekọrọ, ọ bụ ezie na obere ike ndụ site na otu ihe atụ tumor gbochiri ya itinye ya. Iji nweta ọtụtụ nhọrọ nke ndị ọrịa, anyị jikọtara ihe nlele nke onye ọrịa ọ bụla n'okporo ụzọ nke njikwa chromium 10x, ma nyochaa ascites na ebe etuto ahụ iche iche. Mgbe emechara usoro [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp paired end (PE), mkpụrụ ndụ ihe nketa Quebec; Nkezi nke ọnụọgụgụ 73,488 na 41,378 kwa mkpụrụ ndụ maka etuto ahụ na ascites n'otu n'otu]], anyị jiri CellSNP na Vireo (53) (dabere na CellSNP dị ka SNP mmadụ nkịtị (VCF) nke GRCh38 nyere bụ njirimara onye nyere onyinye. Anyị na-eji SNPRelate chọpụta njirimara kacha nso (IBS) nke ọnọdụ genotype nke onye ọrịa (IBS), na-ewepụ mkpụrụ ndụ na mkpụrụ ndụ ndị a na-ekeghị ekenye dị ka duplexes na ndị na-enye onyinye kwekọrọ n'etiti ascites na ihe atụ tumor (54). Dabere na ọrụ a, anyị jigidere ikpe atọ nwere oke nnọchite anya mkpụrụ ndụ na etuto ahụ na ascites maka nyocha ala. Mgbe anyị mechara usoro nzacha oke na ngwugwu scater (55) na scran (56) BioConductor, nke a wetara mkpụrụ ndụ 6975 (mkpụrụ ndụ 2792 na 4183 sitere na etuto ahụ na ascites, n'otu n'otu) maka nyocha. Anyị na-eji nchịkọta igraph (57) nke netwọk agbata obi kacha nso kesara (SNN) dabere na anya Jaccard na mkpụrụ ndụ site na ngosipụta. E ji aka dee mkpụrụ ndụ ndị a na ụdị mkpụrụ ndụ putative dabere na ngosipụta mkpụrụ ndụ ihe nrịbama ma jiri t-SNE hụ ha. A na-akọwa mkpụrụ ndụ T Cytotoxic site na ngosipụta nke CD8A na GZMA, ewezuga obere mkpụrụ ndụ nwere obere ngosipụta protein ribosomal. Anyị nwetara data ebipụtara nke Izar et al. (16), gụnyere itinye t-SNE ha, nwere ike ijikwa njikọ okwu dị n'etiti ihe nrịbama mkpụrụ ndụ ihe mgbochi na ngosipụta NNMT.
E kewapụrụ PBMC na ngwaahịa nkewa leukocyte (STEMCELL Technologies) site na centrifugation Ficoll gradient density centrifugation. E kewapụrụ mkpụrụ ndụ CD3 + na PBMC site na iji beads CD3 (Miltenyi). Mgbe MNA nọ ma ọ bụ na-anọghị ya, e ji CD3 (5μg/ml), CD28 (3μg/ml) na IL-2 (300 U/ml; Proleukin) rụọ ọrụ mkpụrụ ndụ CD3+. N'ụbọchị ikpeazụ nke mgbasawanye, e jiri cytometry na-enyocha viability (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) na proliferation (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific). Nyochaa ọrụ nke onye na-eme ihe site n'ịkpalite mkpụrụ ndụ nwere PMA (20 ng/ml) na ionomycin (1μg/ml) na GolgiStop ruo awa anọ, ma lelee CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) na TNFα-fluorescein isothiocyanate (FITC) (MAb11, BD). Mee ka mkpụrụ ndụ qPCR na ChIP nwee PMA (20 ng/ml) na ionomycin (1μg/ml) ruo awa anọ. E jiri PMA (20 ng/ml) na ionomycin (1 μg/ml) chịkọta ihe na-eme ka ELISA dị elu tupu na mgbe e tinyere ya n'ọrụ.
Soro usoro nke onye nrụpụta iji kewapụ RNA site na iji RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). Jiri QIAshredder (QIAGEN) mee ka ihe nlele ahụ yie otu. Jiri RNA dị elu na ngwa cDNA (Thermo Fisher Scientific) iji mepụta DNA mgbakwunye (cDNA). Jiri TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) tụọ ngosipụta mkpụrụ ndụ ihe nketa (dịka usoro onye nrụpụta si dị) yana nyocha ndị a: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [glyceraldehyde-3-phosphate off Hydrogen (GAPDH)] na Hs01010726_m1 (SLC22A2). E tinyere ihe nlele ndị a na sistemụ PCR nke StepOnePlus (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) na efere mmeghachi omume MicroAmp ngwa ngwa nke 96-well (Applied Biosystems) nke nwere ihe nkiri optical MicroAmp. A na-ewere uru Ct ọ bụla gafere 35 dị ka ihe karịrị oke nchọpụta ma a na-akara ya akara dị ka ihe a na-apụghị ịchọpụta.
Mee ChIP dịka akọwara na mbụ (58). Na nkenke, e jiri formaldehyde gwọọ mkpụrụ ndụ ndị ahụ (njupụta ikpeazụ bụ 1.42%) ma tinye ya n'ime ite ọkụ ụlọ maka nkeji iri. Jiri ihe nchekwa mbufụt agbakwunyere (25 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl na 0.1% NP-40) n'elu ice maka nkeji iri, wee jiri ihe nchekwa immunoprecipitation ọzọ dịka akọwara (58). E jiri usoro ndị a sonicates sample ahụ: okirikiri iri (20 1-sekọnd pulses) na oge static nke sekọnd iri anọ. Incubate ChIP-grade immunoglobulin G (Teknụzụ Mgbaàmà Cell; 1μl), histone H3 (Teknụzụ Mgbaàmà Cell; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) na SP1 (Teknụzụ Mgbaàmà Cell; 3μl) na sample na 4°CC maa jijiji n'abalị. Tinye mkpụrụ osisi A (Thermo Fisher Scientific) na ihe nlele ahụ na 4°C na-ama jijiji nwayọ ruo otu awa, wee jiri mkpụrụ osisi chelex (Bio-Rad) mee ka DNA ahụ baa ụba, ma jiri proteinase K (Thermo Fisher) mee nri protein. PCR chọpụtara onye na-akwalite TNFα site na: forward, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; kama nke ahụ, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (ngwaahịa 207-bp). Image Lab (Bio-Rad) mepụtara onyonyo ndị ahụ ma tụọ ha site na iji ngwanrọ ImageJ.
A chịkọtara ihe na-eme ka mkpụrụ ndụ dị n'ime ya pụta dịka akọwara n'elu. Emere mkpebi ahụ dịka usoro onye nrụpụta si dị nke ngwa TNFα ELISA mmadụ (Invitrogen), ngwa ELISA mmadụ IL-2 (Invitrogen) na ngwa ELISA mmadụ (Abcam). Dịka usoro onye nrụpụta si dị, a gwakọtara ihe na-eme ka mkpụrụ ndụ dị n'ime ya site na 1:100 iji chọpụta TNFα na IL-2, yana 1:3 iji chọpụta IFN-γ. Jiri EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) tụọ mmịpụta na 450 nm.
E kewapụrụ PBMC na ngwaahịa nkewa leukocyte (STEMCELL Technologies) site na Ficoll gradient density centrifugation. E kewapụrụ mkpụrụ ndụ CD3 + na PBMC site na iji beads CD3 (Miltenyi). Mgbe MNA nọ ma ọ bụ na-anọghị ya, e ji CD3 (5μg/ml), CD28 (3μg/ml) na IL-2 (300 U/ml; Proleukin) rụọ ọrụ mkpụrụ ndụ CD3+ ruo ụbọchị atọ. Mgbe ụbọchị atọ gachara, a chịkọtara mkpụrụ ndụ ndị ahụ ma jiri saline 0.9% saa ha, a kpọnwụkwara pellet ahụ. E jiri cytometry flow (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R configuration) mee ọnụọgụ mkpụrụ ndụ.
Wepụta metabolites dịka akọwara n'elu. E megharịrị ihe a kpọrọ nkụ na mkpokọta nke ihe nhata mkpụrụ ndụ 4000/μl. Nyochaa ihe nlele ahụ site na iji chromatography nke usoro ntụgharị (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) na kọlụm CORTECS T3 (2.1 × 150 mm, nha mkpụrụ 1.6-μm, nha oghere 120-Å; #186008500, Mmiri). Polar mass spectrometer (6470, Agilent), nke electrospray ionization na-arụ ọrụ na ọnọdụ dị mma. Mobile phase A bụ 0.1% formic acid (na H2O), mobile phase B bụ 90% acetonitrile, 0.1% formic acid. Ngụkọta LC bụ nkeji 0 ruo 2 maka 100% A, nkeji 2 ruo 7.1 maka 99% B, na nkeji 7.1 ruo 8 maka 99% B. Mgbe ahụ, gbanwee ogidi ahụ na usoro A na-agagharị agagharị na ọnụego mmiri nke 0.6 ml/min maka nkeji 3. . Ọkwa mmiri ahụ bụ 0.4ml/min, a na-ekpokwa ụlọ kọlụm ọkụ ruo 50°C. Jiri ọkọlọtọ kemịkalụ dị ọcha nke MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Canada) iji guzobe oge nchekwa (RT) na mgbanwe (RT = nkeji 0.882, mgbanwe 1 = 137→94.1, mgbanwe 2 = 137→92, Mgbanwe 3 = 137→78). Mgbe mgbanwe atọ niile mere n'oge nchekwa ziri ezi, a na-eji mgbanwe 1 maka nhazi iji hụ na ọ dị mkpa. E mepụtara usoro ọkọlọtọ nke MNA (Toronto Research Chemical Company) site na ngwakọta usoro isii nke ihe ngwọta ngwaahịa (1 mg/ml) iji nweta ọkọlọtọ nke 0.1, 1.0, 10 na 100 ng/ml na 1.0 na 10μg/ml n'otu n'otu mmiri mmiri. Oke nchọpụta bụ 1 ng/ml, nzaghachi ahịrị dịkwa n'etiti 10 ng/ml na 10 μg/ml. A na-eji ntụtụ ọ bụla nke microlita abụọ nke ihe nlele na ọkọlọtọ maka nyocha LC/MS, a na-agbakwa ihe nlele njikwa mma agwakọta kwa ntụtụ asatọ iji hụ na ikpo okwu nyocha ahụ kwụsiri ike. Nzaghachi MNA nke ihe nlele mkpụrụ ndụ niile ejiri MNA gwọọ dị n'ime oke ahịrị nke nnwale ahụ. Ejiri ngwanrọ nyocha MassHunter quantitative (v9.0, Agilent) mee nyocha data.
E si na Song et al. (59) wepụta ihe owuwu αFR-CAR nke ọgbọ nke abụọ. Na nkenke, ihe owuwu ahụ nwere ihe ndị a: usoro ndu CD8a, iberibe mgbanwe otu agbụ nke mmadụ αFR, mpaghara njikọ CD8a na transmembrane, ngalaba intracellular CD27 na ngalaba intracellular CD3z. GenScript mepụtara usoro CAR zuru oke, wee mepụta ya na vektọ ngosipụta lentiviral nke ọgbọ nke abụọ n'elu kaseti ngosipụta GFP ejiri nyochaa arụmọrụ mgbanwe.
A na-emepụta Lentivirus site na mmịpụta nke mkpụrụ ndụ HEK293T [American Type Culture Collection (ATCC); a na-akụ ya na Dulbecco's modified Eagle medium nke nwere 10% fetal bovine serum (FBS) na 1% PenStrep, ma jiri CAR-GFP vector mee ihe na plasmids nke ngwugwu (psPAX2 na pMD2.G, Addene) na-eji lipofection amine (Sigma-Aldrich). A na-anakọta supernatant nwere nje ahụ awa 48 na 72 mgbe a mịnyechara ya, a na-asacha ya, ma tinye ya na ultracentrifugation. Debe supernatant nje ahụ a mịnyere na -80°C ruo mgbe a mịnyere ya.
A na-ekewapụ PBMC site na ngwaahịa nkewa leukocyte nke onye nyere ya ahụike (STEMCELL Technologies) site na Ficoll gradient density centrifugation. Jiri nhọrọ dị mma nke CD8 microbeads (Miltenyi) iji kewapụ mkpụrụ ndụ CD8+ site na PBMC. Kpọlite ​​mkpụrụ ndụ T na TransAct (Miltenyi) na na TexMACS medium [Miltenyi; ejiri 3% serum mmadụ nke na-anaghị arụ ọrụ nke ọma, 1% PenStrep na IL-2 (300 U/ml) tinye ha. Awa iri abụọ na anọ ka mkpali gasịrị, ejiri lentivirus mịnye mkpụrụ ndụ T (10 μl nke nje virus concentrated maka mkpụrụ ndụ 106). Ụbọchị 1 ruo 3 mgbe enyefechara Cytek Aurora (na FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+), nyochaa ngosipụta GFP nke mkpụrụ ndụ iji gosipụta arụmọrụ transduction nke opekata mpe 30%.
A kụnyere mkpụrụ ndụ CAR-T ruo awa iri abụọ na anọ na Immunocult (STEMCELL Technologies; ejiri 1% PenStrep mee ihe) n'okpuru ọnọdụ ndị a: a naghị agwọ ha, ejiri 250 μM adenosine ma ọ bụ 10 mM MNA gwọọ ha. Mgbe a gwọchara ha tupu oge eruo, a sachara mkpụrụ ndụ CAR-T na PBS ma jikọta ha na mkpụrụ ndụ SK-OV-3 20,000 [ATCC; na McCoy 5A medium (Sigma-Aldrich) ejiri 10% FBS na 1% PenStrep mee ihe na 10: E tinyere oke ihe mmetụta na ihe mgbaru ọsọ nke 1 n'ime okpukpu atọ na ihe mgbochi Immunocult agbakwunyere. E jiri mkpụrụ ndụ SK-OV-3 na mkpụrụ ndụ SK-OV-3 ejiri saponin digitalis (0.5mg/ml; Sigma-Aldrich) mee ihe dị ka njikwa na-adịghị mma na nke dị mma, n'otu n'otu. Mgbe awa iri abụọ na anọ nke ịkọ ihe n'otu oge gasịrị, a chịkọtara ihe fọdụrụnụ ma tụọ lactate dehydrogenase (LDH) dịka ntuziaka onye nrụpụta si dị (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). A gwakọtara ihe fọdụrụnụ LDH 1:50 na nchekwa LDH. A tụrụ pasentị nke igbu mmadụ site na iji usoro a: pasentị nke igbu mmadụ = pasentị nke ndozi / ọnụego igbu mmadụ kachasị x 100%, ebe pasentị nke ndozi = naanị mkpụrụ ndụ co-culture-T, na ọnụego igbu mmadụ kachasị = njikwa njikwa dị mma-adịghị mma.
Dịka akọwara n'akwụkwọ ma ọ bụ ihe na ụzọ dị iche iche, jiri GraphPad Prism 8, Microsoft Excel ma ọ bụ R v3.6.0 maka nyocha ọnụọgụgụ. Ọ bụrụ na a nakọta ọtụtụ ihe nlele site n'otu onye ọrịa (dịka ascites na tumor), anyị na-eji ule t jikọtara ọnụ ma ọ bụ tinye onye ọrịa ahụ dị ka mmetụta enweghị usoro na ụdị linear ma ọ bụ generalized dịka o kwesịrị. Maka nyocha metabolomics, a na-eme ule dị mkpa na triplicate.
Maka ihe ndị ọzọ gbasara akụkọ a, biko lee http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Nke a bụ akụkọ e kesara n'okpuru usoro nke Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, nke na-enye ohere iji, kesaa na imepụtagharị n'ime usoro ọ bụla, ma ọ bụrụhaala na ojiji ikpeazụ abụghị maka uru azụmahịa na ihe kpatara ya bụ na ọrụ mbụ ahụ ziri ezi. Ntuziaka.
Rịba ama: Anyị na-arịọ gị naanị ka ị nye adreesị ozi ịntanetị gị ka onye ị na-akwado na ibe ahụ mara na ịchọrọ ka ha hụ ozi email ahụ nakwa na ọ bụghị spam. Anyị agaghị ejide adreesị ozi email ọ bụla.
A na-eji ajụjụ a anwale ma ị bụ onye ọbịa ma gbochie nnyefe spam akpaghị aka.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bell Jardini Grar Jones (R.ph Nelson) Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA na-enye aka na mgbochi nke mkpụrụ ndụ T ma na-anọchite anya ihe nwere ike ibute immunotherapy maka ọgwụgwọ kansa mmadụ.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bell Jardini Grar Jones (R.ph Nelson) Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA na-enye aka na mgbochi nke mkpụrụ ndụ T ma na-anọchite anya ihe nwere ike ibute immunotherapy maka ọgwụgwọ kansa mmadụ.
©2021 American Association for the Advancement of Science. ikike niile echekwabara. AAAS bụ onye mmekọ nke HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef na COUNTER. Ọganihu sayensị ISSN 2375-2548.